皺邊石杉內(nèi)生真菌ISSR-PCR反應條件的優(yōu)化

史云峰，禹利君，劉仲華，黃璜，胥錦樺，朱楠楠

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 a.東方科技學院；b.農(nóng)學院，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128)

石杉科植物含有治療早老性癡呆癥的特效藥物成分石杉堿甲。若能從其內(nèi)生真菌中獲得可產(chǎn)石杉堿甲的菌株，有望解決早老性癡呆病人的用藥需求。對石杉科植物內(nèi)生真菌的研究起步較晚，主要集中在對其菌種的分離、純化和形態(tài)學初步鑒定[1–3]，對其內(nèi)生真菌進行相關分子標記的研究尚少。內(nèi)部簡單重復序列(inter simple sequence repeat, ISSR)結(jié)合了隨機引物擴增多態(tài) DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)和簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)標記技術(shù)的優(yōu)點，無需知道基因組序列信息，DNA用量少，穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，已廣泛應用于分子標記輔助育種[4–5]、植物病原菌進化與親緣關系分析[6]、遺傳多樣性分析、遺傳作圖、基因定位等[7–9]。ISSR反應易受Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物及退火溫度的影響，不同物種的試驗參數(shù)均有差異。以皺邊石杉(Huperzia crispata)內(nèi)生真菌的 DNA 為材料，對其ISSR–PCR反應體系進行單因素試驗及正交試驗優(yōu)化，旨在建立穩(wěn)定、可靠的 ISSR–PCR反應體系，為后期從分子水平對皺邊石杉內(nèi)生真菌進行分類鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析及種質(zhì)資源的優(yōu)選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮皺邊石杉樣品采自湖南湘西自治州永順縣小溪原始次生林國家自然保護區(qū)，從中分離純化的 99株內(nèi)生真菌保存于湖南農(nóng)業(yè)大學國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心。

Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia，UBC)公布的植物病源基因真菌DNA的ISSR引物信息，由南京金斯特科技有限公司合成引物。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)生真菌獲菌絲體。將菌絲體用無菌超純水洗凈作為DNA提取材料。采用氯化芐改良法，結(jié)合超聲破壁處理提取DNA[10–11]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量與純度。將所提取的DNA與標準DNA進行濃度比較，稀釋至30 ng/μL備用。

1.2.2 ISSR引物篩選

將99株內(nèi)生真菌DNA隨機混合后分成10份，根據(jù)各ISSR引物Tm值將100條引物分成10組，探索各引物退火溫度。采用 Biometra T–Gradient Thermoblock PCR儀對混合DNA樣本進行PCR擴增，從100條ISSR引物中篩出譜帶清晰、多態(tài)性高的引物。

1.2.3 ISSR–PCR反應體系的參數(shù)優(yōu)化

對 25 μL ISSR–PCR 反應體系分別設定 5個DNA 模板濃度(10、20、30、40、50 ng/(25 μL))，5個 Taq DNA 聚合酶濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3 U/μL)，6個Mg2+濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L)，5 個dNTPs濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)?；AISSR–PCR擴增體系為25 μL?；A反應體系中含 10×PCR Buffer(Mg2+濃度為 2.5 mmol/L)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，引物(10 pmol/μL)1.25 μL，Taq E(1U/μL)1.25 μL，DNA 模板(10 ng/μL)2.5 μL，無菌ddH2O 17 μL。對照以ddH2O代替模板DNA。PCR程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，適宜溫度(最適退火溫度因引物而異)下退火 45 s，72 ℃延伸60 s，共30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳2 h，于自動凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，照相。

1.2.4 ISSR–PCR正交試驗設計

在單因素優(yōu)化條件的基礎上，采用正交設計L9(34)對影響ISSR–PCR反應的DNA模板濃度、Taq DNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度4個因素，各設置3個水平試驗，共9個處理，每個處理設置平行反應(表1)，以建立最優(yōu)PCR反應體系。

表1 ISSR–PCR反應因素的L9(34)正交試驗設計Table1 L9(34)orthogonal design for the factors and levels of ISSR–PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 不同參數(shù)對ISSR–PCR反應結(jié)果的影響

2.1.1 引物最適退火溫度的確定

對初步篩選出的41條ISSR引物進行適宜退火溫度探索。退火溫度取決于引物的長度、濃度和引物的堿基組成，在各引物Tm值低5 ℃的溫度上、下各浮動 7.5 ℃。設定 12個退火溫度梯度，進行PCR擴增，確定10條穩(wěn)定好、多態(tài)性高ISSR引物的適宜退火溫度。這 10條引物分別為 UBC842、UBC848、UBC850、UBC856、UBC861、UBC864、UBC868、UBC873、UBC880、UBC887(表 2)。

表2 10條用于ISSR–PCR擴增引物的退火溫度Table 2 Ten ISSR primers for ISSR–PCR amplification and their annealing temperatures

2.1.2 適宜DNA模板濃度的確定

圖1 引物UBC856和UBC848在不同DNA模板濃度下的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products amplified using primers UBC856 and UBC848 with different concentrations of DNA template

由圖1可知，25 μL反應體系中，模板DNA為20～60 ng，UBC856、UBC848均可擴增出清晰的DNA條帶。模板量增加對擴增結(jié)果的影響不明顯。因DNA在使用過程中經(jīng)歷凍融后會發(fā)生部分降解，為節(jié)約模板用量，并獲得清晰的擴增條帶，本擴增體系中選取DNA模板30 ng。

2.1.3 適宜Mg2+濃度的確定

從圖2可知，選用UBC848、UBC856引物進行 Mg2+濃度探索，當 Mg2+濃度分別為 0.5～3.0 mmol/L時，反應結(jié)果差異顯著；當Mg2+濃度低于1.5 mmol/L時均無明顯擴增條帶，可見，Mg2+濃度過低，Taq酶的作用效率低，不能有效擴增；Mg2+濃度過高，可能會產(chǎn)生非特異性擴增，導致條帶彌散。圖2中11、12泳道泛白拖尾主要是在電泳載樣時槍頭對點樣孔有輕微的戳破，樣品沒有全部沉入點樣孔底部，部分樣品留在瓊脂糖凝膠表層，導致帶型不是非常集中。以Mg2+濃度相對較低，且能擴增出豐富的特異性條帶為選擇標準，UBC848、UBC856引物的適宜Mg2+濃度為2.0 mmol/L。

圖2 引物UBC856和UBC848在不同Mg2+濃度下的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR products amplified using primers UBC856 and UBC848 with different Mg2+ concentrations

2.1.4 適宜Taq酶濃度的確定

由圖 3可知，在 Taq酶濃度為 1.0～3.0 U/μL和 UBC856、UBC848在Taq酶濃度分別為1.5、2.0 U/μL時，可擴增出清晰的DNA多態(tài)性條帶；當Taq酶濃度為1.0 U/μL時，2條引物擴增出的條帶均較弱，不太清晰；當 Taq酶濃度為 2.5 U/μL時，其擴增條帶呈減弱趨勢?？梢?，在該反應體系中，Taq酶濃度為1.5～2.0 U/μL是適宜的。從節(jié)約試劑成本角度考慮，選取1.5 U/μL為Taq酶適宜濃度。

圖3 引物UBC856和UBC848在不同Taq酶濃度下的電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophoresis of PCR products amplified using primers UBC856 and UBC848 with different concentrations of Taq polymerase

2.1.5 適宜dNTPs濃度的確定

dNTPs作為PCR反應的原料，濃度太低會使擴增反應不完全，從而降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量；濃度過高會對Mg2+產(chǎn)生抑制作用，影響Taq酶活力，造成浪費。從圖4可知：當dNTPs濃度為0.2～1.0 mmol/L時，反應結(jié)果差異顯著；dNTPs濃度為 0.4～0.6 mmol/L時可得到較清晰的擴增條帶。若dNTPs濃度繼續(xù)加大，UBC856號引物的條帶消失。UBC856引物在dNTPs濃度0.4、0.6 mmol/L擴出的條帶帶型一致，但條帶亮度有差異，主要是UBC856–2泳道在電泳載樣時槍頭對點樣孔有輕微的戳破，部分樣品留在瓊脂糖凝膠表層，帶型有些彌散。

圖4 引物UBC856和UBC848在不同dNTPs濃度下的電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of PCR products amplified using primers UBC856 and UBC848 with different concentrations of dNTPs

2.2 ISSR–PCR最優(yōu)反應體系的建立

根據(jù) L9(34)正交試驗設計，對皺邊石杉內(nèi)生真菌菌絲體DNA混合模板進行ISSR–PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖5可知，以7號處理進行擴增，其平行樣重復好，多態(tài)性條帶最豐富。25 μL ISSR–PCR 擴增體系為：10×PCR Buffer(Mg2+濃度為 2.0 mmol/L)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.6 μL，引物(10 pmol/μL)2.0 μL，Taq E(1 U/μL)1.5 μL，DNA模板(10 ng/μL)3 μL，無菌 ddH2O 15.4 μL。

圖5 ISSR–PCR優(yōu)化體系電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis for the optimized ISSR–PCR reaction system

2.3 UBC873引物對99株內(nèi)生真菌ISSR–PCR擴增結(jié)果的驗證

以UBC873引物對99株內(nèi)生真菌基因組DNA進行PCR擴增。按照形態(tài)學初步歸類比對結(jié)果，將相似性較高菌株的ISSR–PCR產(chǎn)物鄰接點樣，擴增產(chǎn)物大小為200～2 000 bp(圖6)。從圖6可知：皺邊石杉內(nèi)生真菌資源間的 ISSR多態(tài)性水平較高，其中1號和2號、46號和52號、63號和64號、43號和44號、35號和42號這5對菌株菌絲體DNA的ISSR指紋圖譜幾乎一致，可初步推定這5對菌株中各有1個重復菌種，其他均為親緣關系或遠或近的不同菌種。由此可知，皺邊石杉內(nèi)生真菌資源遺傳多樣性非常豐富。

圖6 引物UBC873對99株內(nèi)生真菌的擴增結(jié)果Fig.6 Amplification results for 99 endophytic fungi strains of Huperzia crispata using primer UBC 873

3 結(jié)論與討論

確定ISSR–PCR反應的適宜退火溫度是決定試驗成敗的前提。引物退火溫度不僅與引物序列有關，還與物種DNA的序列密切相關[12–13]。通常引物退火溫度比引物的Tm值低5 ℃左右。本試驗中，為快速確定100條ISSR引物的最適退火溫度，根據(jù)其Tm值將引物分成10組，在各引物Tm值低5 ℃的溫度上、下各浮動7.5 ℃，設定12個溫度梯度，并將99個DNA模板隨機混合，進行合適引物及其最佳退火溫度篩選，確定了 UBC842、UBC848、UBC850、UBC856、UBC861、UBC864、UBC868、UBC873、UBC880及UBC887等10條穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的ISSR引物作為皺邊石杉內(nèi)生真菌ISSR分析的合適引物。

在建立皺邊石杉內(nèi)生真菌ISSR–PCR擴增優(yōu)化體系的過程中，參照植物病原菌 ISSR擴增的反應體系[6,8,14]來確定ISSR基礎反應體系，在此基礎上進行模板DNA濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度的單因素試驗和正交試驗，得到最優(yōu)反應體系(25 μL)：10×PCR Buffer(Mg2+濃度為 2.0 mmol/L)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.6 μL，引物(10 pmol/μL)2.0 μL，Taq E(1U/μL)1.5 μL，DNA 模板(10 ng/μL)3 μL，無菌ddH2O 15.4 μL。以此優(yōu)化的擴增體系，選用UBC873引物對99株內(nèi)生真菌進行擴增驗證，獲得了良好的結(jié)果，可供后續(xù)皺邊石杉內(nèi)生真菌的遺傳多樣性及遺傳圖譜構(gòu)建研究參考。

[1]Wang Y，Zeng Q G，Zhang Z B，et al.Isolation and characterization of endophytic(huperzine A–producing fungi from Huperzia serrata[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2010，38(9)：1267–1278.

[2]鞠鏨，王峻，潘勝利.4種石杉科植物中產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌的分離及初步鑒定和HPLC測定石杉堿甲的含量[J].復旦學報：醫(yī)學版，2009，36(4)：445–449.

[3]范鐵芳，史云峰，楊培迪，等.皺邊石杉內(nèi)生菌J060918產(chǎn)四草酸鉀的發(fā)酵條件[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2008，34(4)：409–412.

[4]鄭海燕，粟建光，戴志剛，等.利用 ISSR和 RAPD標記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(17)：3499–3510.

[5]王海飛，關建平，馬鈺，等.中國蠶豆種質(zhì)資源ISSR標記遺傳多樣性分析[J].作物學報，2011，37(4)：595–602.

[6]張培培，梁晨.番茄葉霉病菌 ISSR–PCR體系的建立[J].菌物研究，2010，8(2)：107–114.

[7]Raina S N，Rani V，Kojima T，et al.RAPD and ISSR fingerprints as useful genetic markers for analysis of genetic diversity，varietal identification，and phylogenetic relationships in peanut(Arachis hypogaea)cultivars and wild species[J].Genome，2001，44(5)：763–772.

[8]于紅梅，林英任，陳莉，等.皮下盤菌屬種內(nèi)及種間遺傳多樣性的ISSR分子標記[J].微生物學雜志，2009，29(2)：12–16.

[9]Curlevski N J，Chambers S M，Anderson I C，et al.Identical genotypes of an ericoid mycorrhiza-forming fungus occur in roots of Epacris pulchella(Ericaceae)and Leptospermum polygalifolium(Myrtaceae)in an Australian sclerophyll forest[J].FEMS Microbiol Ecol，2009，67(3)：411–420.

[10]禹利君，史云峰，范鐵芳，等.皺邊石杉基因組總DNA保存期間的質(zhì)量檢測分析[J].生物技術(shù)通訊，2007，18(4)：635–637.

[11]史云峰，禹利君，胥錦樺，等.皺邊石杉內(nèi)生真菌DNA快速有效提取的研究[J].中國農(nóng)學通報，2012，28(6)：183–188.

[12]Nazrul M I，Yin–Bing B.ISSR as new markers for identification of homokaryotic protoclones of Agaricus bisporus[J].Curr Microbiol，2010，60(2)：92–98.

[13]孫立夫，裴克全，張艷華，等.法國蜜環(huán)菌 Armillaria gallica 菌株遺傳多樣性的 ISSR分析[J].菌物學報，2011，30(5)：686–694.

[14]趙云福，劉翠，梁晨，等.白粉寄生孢ISSR–PCR體系的建立及遺傳多樣性的初步分析[J].菌物學報，2010，29(5)：653–664.