苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學(xué)觀察及抗氧化能力變化

曾 婷馮 琳，2，3劉 揚(yáng)，2，3姜 俊，2，3周小秋，2，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;3.魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

苯丙氨酸(Phe)是魚(yú)類的必需氨基酸［1］。目前，有關(guān)苯丙氨酸缺乏對(duì)魚(yú)類影響的研究主要集中在生長(zhǎng)性能方面。研究表明，苯丙氨酸缺乏導(dǎo)致印度鯉魚(yú)(Cirrhinus mrigala)［2］和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［3］等魚(yú)類生長(zhǎng)速度降低，飼料利用率和體蛋白質(zhì)沉積下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸缺乏使異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的肝胰臟重量降低，肝臟中的脂肪含量升高［4］。而關(guān)于魚(yú)類缺乏苯丙氨酸的表觀癥狀和病理組織學(xué)變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。動(dòng)物體內(nèi)的許多物質(zhì)代謝后會(huì)產(chǎn)生羥自由基(·OH)，羥自由基可與蛋白質(zhì)、核酸等多種大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而影響細(xì)胞功能［5］。在犬上的研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸的苯環(huán)可與羥自由基結(jié)合形成鄰位－酪氨酸(o-Tyr)、間位－酪氨酸(m-Tyr)和對(duì)位－酪氨酸(p-Tyr)3種羥化產(chǎn)物，從而能夠在一定程度上清除羥自由基［6］。因此，苯丙氨酸可能與動(dòng)物的抗氧化能力有關(guān)。本文通過(guò)飼喂幼建鯉苯丙氨酸缺乏飼料，旨在研究苯丙氨酸缺乏對(duì)幼建鯉組織器官病理變化以及抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料

選擇平均體重為(7.53±0.01)g的健康幼建鯉［購(gòu)于通威原(良)種漁場(chǎng)］400尾，隨機(jī)分為2組(缺乏組和對(duì)照組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾魚(yú)，組間初始體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)飼料是以魚(yú)粉(智利進(jìn)口的白魚(yú)粉)、明膠和晶體氨基酸為主要蛋白質(zhì)源的半純合飼料。除苯丙氨酸外的必需氨基酸組成模擬34%全卵蛋白質(zhì)模式［7］，不足的必需氨基酸以晶體氨基酸形式添加。缺乏組飼料中苯丙氨酸含量實(shí)測(cè)值為1.9 g/kg，對(duì)照組飼料中苯丙氨酸含量根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的幼建鯉苯丙氨酸需要量設(shè)計(jì)，實(shí)測(cè)值為10.9 g/kg。試驗(yàn)飼 料 中 鋅［8］、鐵［9］、維 生 素 B6［10］、泛 酸［11］、肌

醇［12］、硫胺素［13］和核黃素［14］含量根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室研究得出的幼建鯉對(duì)相應(yīng)物質(zhì)的需要量確定，鉀、鈉、碘、硒、維生素D和維生素B12含量參照虹鱒的需要量確定，維生素K含量參照湖鱒的需要量確定，其他營(yíng)養(yǎng)素的含量參照NRC(1993)鯉魚(yú)營(yíng)養(yǎng)需要量確定。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) g/kg

1.2 飼養(yǎng)管理

將購(gòu)回的魚(yú)苗用氯化鈉(0.8%)、碳酸氫鈉(0.4%)消毒并分組，以重復(fù)為單位飼喂于配有自動(dòng)循環(huán)水過(guò)濾系統(tǒng)和自動(dòng)增氧系統(tǒng)的水族箱(90 cm×30 cm×40 cm)中，經(jīng)4周馴化后開(kāi)始正式試驗(yàn)，試驗(yàn)期為60 d。試驗(yàn)期間，經(jīng)生物過(guò)濾池過(guò)濾后的循環(huán)水以1.2 L/min的速度流入水族箱，水溫為(25±2)℃，pH 為 7.0±0.3，溶解氧≥5 mg/L。試驗(yàn)開(kāi)始后每15 d用氯化鈉(0.8%)對(duì)水體消毒1次。馴化期飼料與試驗(yàn)期對(duì)照組飼料一致，馴化期管理模式和水質(zhì)條件與試驗(yàn)期一致。馴化期每天投喂6次，試驗(yàn)期前期(1～30 d)每天投喂6次，后期(31～60 d)每天投喂4次。

1.3 表觀癥狀及病理組織學(xué)觀察

在試驗(yàn)期間，通過(guò)肉眼觀察缺乏組幼建鯉的表觀癥狀，并記錄出現(xiàn)癥狀的時(shí)間、尾數(shù)以及癥狀情況。試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選5尾魚(yú)，分別取腸道(分為前腸、中腸和后腸3段)、肝胰臟、脾臟、鰓絲和肌肉，用100 mL/L的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅(HE)常規(guī)染色，倒置顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化。

1.4 血清抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選6尾魚(yú)，饑餓12 h后尾靜脈采血。血液4℃靜置過(guò)夜后，于3 000×g、4℃離心10 min取血清，－70℃保存，用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。血清丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)羰基含量的測(cè)定分別參照Livingstone等［15］和 Armenteros等［16］的方法;抗超氧陰離子能力(A-SAC)和抗羥自由基能力(A-HRC)的測(cè)定參照J(rèn)iang等［17］的方法;超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性的測(cè)定參照 Zhang等［18］的方法;過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的測(cè)定分別參照 Aebi［19］、Lora 等［20］和 Lushchak等［21］的方法;谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定參照 Vardi等［22］的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 t檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的表觀癥狀

苯丙氨酸缺乏組魚(yú)的眼觀表現(xiàn)為尾鰭向上彎曲(圖1)，開(kāi)始出現(xiàn)缺乏癥狀的時(shí)間為試驗(yàn)開(kāi)始后的第5周。60 d的生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，出現(xiàn)缺乏癥的魚(yú)有56尾，占缺乏組魚(yú)總尾數(shù)的28%。

圖1 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鯉的表觀癥狀Fig.1 Clinical symptom of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days

2.2 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學(xué)觀察

苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學(xué)觀察如圖2所示。前腸、中腸和后腸:缺乏組魚(yú)的前腸、中腸和后腸皺襞頂端黏膜上皮出現(xiàn)凝固性壞死，且部分脫落進(jìn)入腸腔;部分前腸和中腸腸黏膜的固有層輕微水腫，與黏膜上皮之間結(jié)構(gòu)疏松，嚴(yán)重者腸黏膜中的毛細(xì)血管充血。肝胰臟:缺乏組魚(yú)的肝細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡變性，胞核偏于細(xì)胞一側(cè);部分肝細(xì)胞腫脹，體積增大;部分胰腺細(xì)胞腫脹、體積增大，細(xì)胞界限不清，胰腺腺泡中酶原顆粒減少。脾臟:缺乏組魚(yú)的脾臟出現(xiàn)含鐵血紅素沉積。肌肉:缺乏組魚(yú)的部分肌纖維肌漿凝固，形成無(wú)結(jié)構(gòu)的紅染團(tuán)塊，大量肌纖維出現(xiàn)不同程度的肌漿溶解，嚴(yán)重者肌纖維斷裂。后腎:缺乏組魚(yú)的后腎腎小球充血，體積腫大，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔輕度變形。鰓絲:缺乏組魚(yú)的鰓小片毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，嚴(yán)重者鰓小片溶解、脫落，軟骨消失。而對(duì)照組魚(yú)的腸道(前腸、中腸和后腸)、肝胰臟、脾臟、肌肉、后腎和鰓絲的組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。

圖2 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鯉的病理組織學(xué)觀察Fig.2 Histopathological observation of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days(400 × )

2.3 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的抗氧化能力變化

由表2可知，與對(duì)照組相比，缺乏組幼建鯉的血清MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低(P＜0.05);血清 A-SAC、A-HRC，SOD、CAT、GSH-Px、GST、GR活性以及GSH含量顯著升高(P＜0.05)。

表2 苯丙氨酸缺乏對(duì)幼建鯉血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of phenylalanine deficiency on serum antioxidant indices of juvenile Jian carp

3 討論

3.1 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的表觀癥狀

關(guān)于苯丙氨酸缺乏引起魚(yú)類骨骼畸形的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)飼料中苯丙氨酸缺乏時(shí)，部分幼建鯉出現(xiàn)尾鰭向上彎曲的表觀癥狀。這可能與苯丙氨酸影響了參與骨骼骨化物質(zhì)的合成有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學(xué)觀察

腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場(chǎng)所，腸黏膜屏障系統(tǒng)具有阻礙腸腔內(nèi)細(xì)菌入侵和毒素吸收的功能［23］，因此，腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于動(dòng)物機(jī)體十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸缺乏導(dǎo)致幼建鯉的前腸、中腸和后腸腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，并且有些腸段出現(xiàn)黏膜毛細(xì)血管充血和固有層水腫的現(xiàn)象，表明苯丙氨酸缺乏會(huì)影響魚(yú)類腸道結(jié)構(gòu)完整性。腸道結(jié)構(gòu)完整性與腸道消化酶和刷狀緣酶活性密切相關(guān)［24］。姜維丹等［25］研究發(fā)現(xiàn)，肌醇缺乏引起幼建鯉腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性受損的同時(shí)，消化吸收功能也有所下降。因此，苯丙氨酸缺乏可能通過(guò)影響腸道結(jié)構(gòu)完整性來(lái)進(jìn)一步影響腸道的消化吸收功能。在本試驗(yàn)中，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾臟、后腎、鰓小片和肌纖維也發(fā)生不同程度的病理變化。在異育銀鯽上的研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸缺乏導(dǎo)致肝胰臟重量下降，肝臟脂肪含量顯著增加［5］。上述結(jié)果表明，苯丙氨酸缺乏可能通過(guò)影響魚(yú)類胰腺和肝臟的組織結(jié)構(gòu)來(lái)影響其生長(zhǎng)發(fā)育和正常功能的發(fā)揮，導(dǎo)致消化酶的分泌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝受到影響。關(guān)于苯丙氨酸缺乏對(duì)魚(yú)類組織器官結(jié)構(gòu)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在鼠上的研究顯示，腸道結(jié)構(gòu)和功能與其抗氧化狀態(tài)有關(guān)［22］。因此，本試驗(yàn)中苯丙氨酸缺乏導(dǎo)致的幼建鯉組織器官出現(xiàn)病理變化可能與其抗氧化能力降低有關(guān)。

3.3 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的抗氧化能力變化

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物［26］，MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度;蛋白質(zhì)羰基是蛋白質(zhì)氧化的重要標(biāo)記［27］，蛋白羰基含量可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)氧化損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苯丙氨酸缺乏時(shí)，幼建鯉的血清MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著提高，表明苯丙氨酸缺乏導(dǎo)致魚(yú)體的氧化損傷增加。超氧陰離子和羥自由基是2種常見(jiàn)的氧自由基，當(dāng)其含量超出正常水平時(shí)，就會(huì)引發(fā)機(jī)體本身的脂質(zhì)過(guò)氧化以及糖基和蛋白質(zhì)氧化等氧化應(yīng)激［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的血清A-SAC和A-HRC均顯著降低，說(shuō)明機(jī)體對(duì)超氧陰離子和羥自由基的清除能力降低。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生自由基時(shí)，機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶和低分子抗氧化物質(zhì)則開(kāi)始參與還原自由基的過(guò)程，從而達(dá)到解毒的目的［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的血清抗氧化酶活性以及GSH含量均顯著降低，說(shuō)明苯丙氨酸缺乏時(shí)機(jī)體中和自由基的能力即解毒能力減弱。苯丙氨酸缺乏引起機(jī)體抗氧化能力降低可能是導(dǎo)致內(nèi)臟器官和肌肉組織病變的原因之一。

4 結(jié)論

①苯丙氨酸缺乏可引起幼建鯉尾鰭向上彎曲，組織器官出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷。

②苯丙氨酸缺乏可導(dǎo)致幼建鯉抗氧化能力降低，氧化損傷增加。

［1］BENAKAPPA S，VARGHESE T J.Total aromatic amino acid requirement of the India major carp，Cirrhinus mrigala(Hamilton-buchanan)［J］.The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh，2004，56:129－135.

［2］AHMED I.Dietary total aromatic amino acid requirement and tyrosine replacement value for phenylalanine in Indian major carp:Cirrhinus mrigala(Hamilton)fingerlings［J］. Journal ofApplied Ichthyology，2009，25(6):719－727.

［3］KIM K.Requirement for phenylalanine and replacement value of tyrosine for phenylalanine in rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)［J］. Aquaculture，1993，113:243－250.

［4］馬志英，朱曉鳴，解綬啟，等.異育銀鯽幼魚(yú)對(duì)飼料苯丙氨酸需求的研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2010，34(5):1012－1020.

［5］CUI K，LUO X L，XU K L，et al.Role of oxidative stress in neurodegeneration:recent developments in assay methods for oxidative stress and nutraceutical antioxidants［J］.Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2004，28(5):771－799.

［6］SUN J Z，KAUR H，HALLIWELL B，et al.Use of aromatic hydroxylation of phenylalanine to measure production of hydroxyl radical after myocardial ischemia in vivo.Direct evidence for a pathogenetic role of the hydroxyl radicals in myocardial stunning［J］.Circulation Research，1993，73(3):534－549.

［7］CHANCE R E，MERTZ E T，HALVER J E.Nutrition of salmonoid fishes.Isoleucine，leucine，valine and phenylalanine requirements of chinook salmon and interrelationsbetween isoleucine and leucine for growth［J］.The Journal of Nutrition，1964，83:177－185.

［8］TAN L N，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary zinc［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(3):338－345.

［9］LING J，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Effect of dietary iron levels on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:616－624.

［10］HE W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Dietary pyridoxine requirement of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15:402－408.

［11］WEN Z P，F(xiàn)ENG L，JIANG J，et al.Immune response，disease resistance and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of pantothenic acid［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:430－436.

［12］JIANG W D，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Growth，digestive capacity and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary inositol［J］.Aquaculture Research，2009，40:955－962.

［13］HUANG H H，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Effects of dietary thiamin supplement on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17:233－240.

［14］LI W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Effect of dietary riboflavin on growth，feed utilization，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:137－143.

［15］LIVINGSTONE D R，GARCIA M P，MICHEL X，et al.Oxyradical production as a pollution-mediated mechanism of toxicity in the common mussel，Mytilus edulis L.and other molluscs［J］.Functional Ecology，1990，4(3):415－424.

［16］ARMENTEROS M，HEINONEN M，OLLILAINEN V，et al.Analysis of protein carbonyls in meat products by using the DNPH-method，fluorescence spectroscopy and liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry(LC-ESI-MS)［J］.Meat Science，2009，83(1):104－112.

［17］JIANG J，ZHENG T，ZHOU X Q，et al.Influence of glutamine and vitamin E on growth and antioxidant capacity of fish enterocytes［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15(4):409－414.

［18］ZHANG X D，ZHU Y F，CAI L S，et al.Effects of fasting on the meat quality and antioxidant defenses of mar-ket-size farmed large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)［J］.Aquaculture，2008，280:136－139.

［19］AEBI H.Catalase in vitro［J］.Methods Enzymology，1984，105:121－127.

［20］LORA J，ALONSO F J，SEGURA J A，et al.Antisense glutaminase inhibition decreases glutathione antioxidant capacity and increases apoptosis in Ehrlich ascitic tumour cells［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271:4298－4306.

［21］LUSHCHAK V I，LUSHCHAK L P，MOTA A A，et al.Oxidative stress and antioxidant defenses in gold-fish Carassius auratus during anoxia and reoxygenation［J］.American Journal of Physiology，2001，280:100－107.

［22］VARDI N，PARLAKPINAR H，OZTURK F，et al.Potent protective effect of apricot and β-carotene on methotrexate-induced intestinal oxidative damage in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46(9):3015－3022.

［23］WANG Z R，QIAO S Y，LU W Q，et al.Effects of enzyme supplementation on performance，nutrient digestibility，gastrointestinal morphology，and volatile fatty acid profiles in the hindgut of broilers fed wheatbased diets［J］.Poultry Science，2005，84(6):875－881.

［24］ULLRICH R，ZEITZ M，HEISE W，et al.Small intestinal structure and function in patients infected with human immunodeficiency virus(HIV):evidence for HIV-induced enteropathy［J］.Annals of Internal Medicine，1989，111:15－21.

［25］姜維丹，劉揚(yáng)，馮琳，等.幼建鯉肌醇缺乏的病理組織學(xué)觀察及抗氧化能力和腸道菌群變化［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39:64 －69.

［26］REQUENA J R，F(xiàn)U M X，AHMED M U，et al.Lipoxidation products as biomarkers of oxidative damage to proteins during lipid peroxidation reactions［J］.Nephrology Dialysis Transplantation，1996，11(Suppl.5):48 －53.

［27］BALTACIOGLU E，AKALIN F A，ALVER A，et al.Protein carbonyl levels in serum and gingival in patients with chronic periodontitis［J］.Archives of O-ral Biology，2008，53(8):716－722.

［28］SIES H.Glutathione and its role in cellular functions［J］.Free Radical Biology and Medicine，1999，27(9/10):916－921.