飼糧添加共軛亞油酸對肉仔雞腸道黏膜免疫反應的影響

劉永祥劉艷麗徐秋良姜東風楊建平

(1.河南省高校動物營養(yǎng)與飼料工程技術研究中心，鄭州 450011;2.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校，鄭州 450011)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是含有共軛雙鍵亞油酸的空間和幾何異構體的一類化合物的總稱，屬多不飽和脂肪酸家族的成員，具有抗癌、預防心血管疾病、糖尿病及控制體重等多種生理活性，其調節(jié)免疫和炎癥反應的功效被廣泛認可［1］。在動物生產方面，人們致力于生產富含CLA的動物產品以滿足人類的健康需求，同時利用CLA的免疫調節(jié)作用，緩解畜禽免疫應激，保證畜禽正常生長。

腸道黏膜免疫是動物機體數量最大、最復雜的免疫系統，在對抗有害飼糧抗原和腸道病原微生物方面發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，母鼠飼糧添加CLA能夠提高幼鼠腸道分泌型免疫球蛋白 A(secretory immunoglobulin A，SIgA)含量［2］。從母豬懷孕至肉豬生長育肥期，在飼糧中添加CLA能夠提高肉豬腸道SIgA含量，增強腸道細胞免疫功能［3］。在病原菌Brachyspira hyodysenteriae誘導仔豬腸炎的試驗中，飼糧添加CLA能夠增強仔豬結腸過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因mRNA的表達，緩解炎癥相關的腸道黏膜損傷［4］。上述研究顯示，CLA和腸道黏膜免疫反應存在密切的關系。在家禽科學方面，有關CLA的研究集中在提高禽產品的CLA含量及利用CLA改善機體脂類代謝從而提高肌肉率［5-7］，少量的研究涉及CLA對肉仔雞的免疫調節(jié)特性［8-9］，但CLA對家禽腸道黏膜免疫反應的研究尚屬空白。

基于CLA和豬鼠等動物腸道黏膜免疫的密切關系，我們推斷CLA可能影響肉仔雞腸道黏膜免疫反應。本試驗參考前人的研究［8-9］，選擇1%CLA添加量，研究CLA對肉仔雞空腸SIgA分泌和小腸黏膜細胞免疫反應的影響，旨在為采取營養(yǎng)措施調控肉仔雞的腸道免疫反應，保證肉仔雞正常生長提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧

試驗選用72只1日齡健康、體重相近的愛拔益加(AA)雄性肉仔雞，隨機分配到對照組和CLA組，每組6個重復，每個重復6只雞，2組分別飼喂基礎飼糧和在基礎飼糧中添加1%CLA的飼糧。飼糧參考NRC(1994)標準配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，CLA組以1%CLA替代等量豆油，試驗所用的CLA(80.8%)購自青島澳海生物有限公司。肉仔雞購自本地孵化場，初始體重差別控制在1.5 g。采用3層鍍鋅雞籠飼養(yǎng)，人工控溫，最初5 d的溫度控制在31～33℃，以后每周降低2～3℃。肉仔雞飼養(yǎng)按常規(guī)程序飼養(yǎng)和免疫，直到21日齡。

1.2 樣品采集與指標測定

1.2.1 生長性能

試驗開始和結束時，以重復為單位分別稱重，統計階段平均日采食量和料重比，發(fā)生死亡時，隨時記錄飼料消耗量和死淘汰雞的體重。

1.2.2 空腸內容物SIgA測定

肉仔雞于21日齡宰殺，收集空腸內容物，內容物與生理鹽水按1∶1(質量體積比)稀釋，混勻后5 000×g 4℃離心15 min，分離上清液。按ELISA試劑盒說明測定SIgA含量，ELISA試劑盒購自上海滬峰生物科技有限公司。

1.2.3 空腸黏膜SIgA、PPARγ 和轉化生長因子β4(transforming growth factor-β4，TGFβ4)基 因mRNA表達檢測

取21日齡肉仔雞空腸中段2～3 cm，縱形剖開，用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，取組織樣30～50 mg，液氮速凍后，置入 -80℃保存?？俶RNA分離采用TRIZOL一步法，即組織樣品在1 mL TRIZOL中充分勻漿，勻漿液12 000×g 4℃離心10 min以去除不溶成分。

實時熒光PCR檢測基因mRNA表達。各基因引物序列如下，根據GenBank發(fā)表的雞PPARγ基因mRNA(XM414308)序列為模板設計引物為:5'-GGGCGATCTTGACAGGAA-3'，5'-GCCTCCACAGAGCGAAAC-3'。根據 GenBank發(fā)表的雞SIgA基因mRNA(S40610)序列為模板設計引物為:5'-TAGATAACCTCGAGCCGATCGCA-3'，5'-GACTTGCCCTCCAATGGATCCTC-3'。根 據 Gen-Bank發(fā)表的雞TGFβ4基因mRNA(M31160)序列為模板設計引物為:5'-CGGGACGGATGAGAAGAAC-3'，5'-CGGCCCACGTAGTAAATGAT-3'。根據GenBank發(fā)表的雞 β-肌動蛋白(β-actin)基因mRNA(NM 205518)序列為模板設計引物為:5'-TCTGGTGGTACCACAATGTACCCT-3'，5'-CCAGTAATTGGTACCGGCTCCTC-3'。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

PCR反應體系為:1 μL cDNA、上游和下游引物(0.25 μmol)各 0.6 μL、5.3 μL 雙蒸水(無RNA 酶)、7.5 μL SYBR Green PCR master Mix(ABI公司，美國)，反應總體積為15 μL。擴增條件為:55℃ 2 min，94℃預變性10 min，94℃變性15 s、53.5 ℃退火30 s、72 ℃ 延伸 30 s擴增 30 個循環(huán)，每個樣品設3個重復。以β-actin為參比。

1.2.4 Peyer氏結淋巴細胞分離、淋巴細胞轉化率和淋巴細胞亞群檢測

Peyer氏結及其淋巴細胞分離按照Vaughn等［10］的方法。截取從麥柯爾盲囊近端大約3 cm到回盲結合部尾端大約2 cm的腸段，用蒸餾水徹底沖洗，在靠近空腸和回腸結合處用鑷子結扎，用10～20 mL稀薄的曙紅液灌注，停留1 min，然后用10～20 mL結晶紫溶液灌注，顯現并切除Peyer氏結，放入冷的RPMI-1640溶液，用手術刀片輕輕切割和碾碎，腸道組織轉移到含10 mmol/L DTT、10-4mol/L EDTA的無鈣、鎂漢克氏平衡鹽溶液(CMF-HBSS，含5%胎牛血清)中，37°C孵育，搖床20 min，釋放的淋巴細胞經300目尼龍網過濾，500×g離心，沉淀懸于HBSS液，反復3次。重懸于HBSS液(含3%胎牛血清)，用Percoll密度離心法分離IEL，4℃，600×g，離心25 min，重懸于HBSS營養(yǎng)液，調整淋巴細胞至1×107個/mL。

MTT法測定淋巴細胞轉化率。將淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，再加入含絲裂原伴刀豆球蛋白(ConA，終濃度45 μg/mL)，對照組則加等體積的不含絲裂原的培養(yǎng)液，培養(yǎng)體系每孔共200 μL，3 個重復。于5%CO2、37 ℃ 下培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入5 mg/mL的 MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結束時，每孔再加入100 μL 10%SDS-0.04 mol/L HCl溶液，30 min 后用酶標儀于570 nm波長下測定OD值。

淋巴細胞亞群檢測。CD4+和CD8+淋巴細胞亞群含量在河南省人民醫(yī)院采用流式細胞儀測定。小鼠抗雞CD4+-PE、CD8+-PE(Southern Biotechnology Associates，Inc，Birmingham，AL)單抗均為熒光標記。

1.3 統計分析

試驗數據表示為平均值±標準差，采用SPSS 11.5統計分析軟件進行t檢驗和相關分析。

2 結果

2.1 生長性能

如表2所示，CLA組和對照組肉仔雞1～21日齡的平均日增重、平均日采食量和料重比之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

表2 飼糧添加CLA對1～21日齡肉仔雞平均日增重、平均日采食量和料重比的影響Table 2 Effects of dietary CLA on average daily gain，average daily feed intake and feed/gain of broiler chicks from 1 to 21 days of age

2.2 空腸食糜 SIgA含量和空腸 SIgA基因mRNA的表達

從表3可以看出，與對照組相比，CLA組肉仔雞空腸食糜SIgA含量和空腸SIgA基因mRNA的表達水平分別提高了 43.58%(P＜0.01)和212.20%(P ＜0.01)，這說明飼糧糧添加 CLA 無論在蛋白質水平還是在基因水平上均提高了SIgA的表達。

表3 飼糧添加CLA對肉仔雞空腸食糜SIgA含量和空腸SIgA基因mRNA表達的影響Table 3 Effects of dietary CLA on jejunal chyme SIgA content and jejunum SIgA gene mRNA expression of broiler chicks

2.3 空腸PPARγ和TGFβ4基因mRNA的表達

從表4可以看出，與對照組相比，CLA組肉仔雞空腸PPARγ基因mRNA表達水平提高了51.56%(P ＜0.01)，但 TGFβ4 基因 mRNA 表達水平在2組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

表4 飼糧添加CLA對肉仔雞空腸PPARγ和TGFβ4基因mRNA表達的影響Table 4 Effects of dietary CLA on jejunum PPARγ and TGFβ4 gene mRNA expression of broiler chicks

2.4 Peyer氏結淋巴細胞轉化率和淋巴細胞亞群

飼糧添加CLA對肉仔雞Peyer氏結淋巴細胞亞群和淋巴細胞轉化率的影響見表5。與對照組相比，CLA組肉仔雞Peyer氏結CD8+淋巴細胞亞群百分數提高了 18.35%(P ＜0.01)，CD4+淋巴細胞亞群百分數有提高的趨勢，但未達到顯著水平(P＞0.05);飼糧添加 CLA顯著提高肉仔雞Peyer氏結淋巴細胞增殖活性(P＜0.05)。

表5 飼糧添加CLA對肉仔雞Peyer氏結淋巴細胞亞群和淋巴細胞轉化率的影響Table 5 Effects of dietary CLA on T lymphocyte subsets of Peyer’s patch and lymphocyte transformation rate of broiler chicks

3 討論

3.1 飼糧添加CLA對肉仔雞生長性能的影響

在本試驗的條件下，飼糧添加1%CLA對1～21日齡肉仔雞平均日增重、平均日采食量和料重比均沒有顯著的影響，這與 Du等［11］和 Simon等［12］的研究結果一致。但 Szymczyk 等［13］發(fā)現在肉仔雞飼糧中添加 CLA(0.50%、1.00% 和 1.50%)顯著降低了平均日采食量和平均日增重，但對料重比無顯著影響。而賀喜等［6］的研究表明飼糧添加1.00%CLA顯著增加長沙黃和AA 2個品種肉仔雞1～21日齡和22～42日齡期間的體增重并改善4～6周齡的飼料轉化率。不同試驗結果的差異還沒有明確的解釋，但可能與CLA添加水平、飼喂時間和動物的營養(yǎng)狀態(tài)、品種等因素有關。

3.2 飼糧添加CLA對肉仔雞空腸SIgA分泌的影響

SIgA是胃腸道提供免疫保護最主要的免疫球蛋白，是黏膜免疫的核心，由于其獨特的分泌成分可降低對蛋白酶的敏感性，保證其黏膜免疫清除功能的充分發(fā)揮，從而阻止外源蛋白和病原微生物的入侵。本試驗首次報道飼糧添加1%CLA無論在蛋白水平還是在基因水平均提高了肉仔雞空腸 SIgA 含量。Pérez-Cano等［2］報道，通過在母鼠飼糧中添加CLA，可提高仔鼠小腸和結腸SIgA基因mRNA表達水平和腸道SIgA含量。Ramírez-Santana等［14］報道，小鼠飼糧長期添加 CLA可提高腸系膜淋巴結特異性卵清蛋白-免疫球蛋白A(OVA IgA)的產量?？傊?，飼糧添加CLA可能對多種動物腸道黏膜SIgA的分泌有廣泛調節(jié)作用。

過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)是核受體家族中的一員，是調控基因轉錄和細胞功能的一個重要成分，與特定的DNA序列即PPAR反應元件(PPRE)結合，調控目的基因的表達。目前的理論認為，CLA具有PPAR激活體的一般結構特點，激活PPAR是CLA發(fā)揮免疫調節(jié)和炎性抑制活性的途徑之一［15］。在誘導性結腸炎(IBD)試驗中，飼糧添加CLA通過激活PPARγ調節(jié)相關基因的表達，緩解仔豬炎性腸病損傷程度［16］。Nicholas等［17］報道，CLA通過PPAR途徑減輕結腸炎癥，阻止腸道腫瘤的形成。本試驗中，飼糧添加CLA提高了空腸PPARγ基因mRNA的表達水平，同時也使SIgA含量和SIgA基因mRNA表達水平增強，這意味著激活PPARγ可能是CLA調節(jié)SIgA表達的途徑之一。

轉化生長因子β(TGFβ)在黏膜位點刺激免疫球蛋白A(IgA)反應中有重要的作用［18］，其介導的信號在免疫球蛋白M(IgM)+B細胞向IgA+B細胞轉化中發(fā)揮重要作用。此外，TGFβ是吸引淋巴細胞向上皮層移居的趨化因子，在IgA+B細胞分化增殖后再到黏膜下固有層中成為成熟IgA漿細胞的過程中發(fā)揮重要作用。但本試驗中該基因mRNA水平在CLA組和對照組之間沒有顯著差異，因此在本試驗的條件下，提高的SIgA基因mRNA表達和蛋白質水平不可能源自TGFβ4的刺激作用。

3.3 飼糧添加CLA對肉仔雞腸道細胞免疫的影響

Peyer氏結是腸道黏膜免疫系統重要的組分，是腸道對外界抗原應答的主要調節(jié)和擴大器，被稱為第2淋巴器官。與哺乳動物的Peyer氏結不同，家禽的Peyer氏結在未固定的狀態(tài)下不太明顯，故其在黏膜免疫中的作用鮮有報道。本試驗采用Vaughn等［10］提出的簡便方法鑒別分離肉仔雞的Peyer氏結。

本試驗發(fā)現飼糧添加1%CLA顯著提高21日齡肉仔雞腸道Peyer氏結淋巴細胞對ConA的增殖活性。關于CLA對淋巴細胞轉化率的影響已有許多報道。飼糧添加CLA增強鼠、豬等動物外周血和脾臟淋巴細胞的增殖活性［19-21］。但家禽方面的研究僅見于Zhang等［9］的報道，與本試驗結果不同的是飼糧添加CLA顯著提高了42日齡時外周血淋巴細胞對ConA的增殖反應，但對肉仔雞21日齡外周血淋巴細胞轉化率無顯著影響。本試驗與Zhang等［9］試驗結果存在差異的原因可能在于淋巴細胞對CLA的反應存在組織差異性;此外，腸道直接處于高濃度的CLA環(huán)境下，可能比外周血淋巴細胞對CLA的反應更快。

本試驗條件下，飼糧添加CLA顯著提高Peyer氏結CD8+淋巴細胞百分數，與以前的研究結果一致，即在缺乏外源刺激的情況下，飼糧添加CLA能夠提高鼠、豬和禽等動物外周血、胸腺、脾臟CD8+T 淋巴細胞數［9，20-22］。CD8+可直接破壞被病毒感染的細胞，防止由Th1和Th2類CD4+T淋巴細胞介導的免疫損傷，在機體抵抗病毒和細菌感染的細胞免疫中發(fā)揮重要的作用。因此，提高的Peyer氏結CD8+T淋巴細胞百分數意味著可能有助于提高肉仔雞抵抗腸道病毒(菌)感染的能力，但其確切的作用尚需進一步的攻毒試驗來驗證。不過這一作用已在豬的研究中得到證實:在腸道病原菌B.hyodysenteriae誘導仔豬腸炎的試驗中，飼糧添加CLA有利于維持正常的淋巴細胞亞群(CD4+和CD8+)并減輕腸道黏膜損傷［4］。

4 結論

①飼糧添加1%CLA無論在蛋白質水平還是在基因水平均提高了21日齡肉仔雞空腸SIgA含量，激活PPARγ可能是CLA調節(jié)SIgA表達的途徑之一。

②飼糧添加1%CLA提高了21日齡肉仔雞Peyer氏結T淋巴細胞轉化率和CD8+T淋巴細胞百分數。

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