五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的毒性及代謝動力學(xué)的研究

李磊，黃清發(fā)，肖雨，孫建華，戚雋淵，孫振中

(上海市水產(chǎn)研究所上海市水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海200433)

五氯酚鈉 (Sodium pentachlorophenol，PCP)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)中，如作為除草劑、殺蟲劑、殺菌劑以及木材防腐處理等，在中國主要用它來進行池塘滅螺［1］。五氯酚鈉具有良好的水溶性，在自然界中降解緩慢，若長期使用，會造成環(huán)境污染，殘留的五氯酚鈉還能通過食物鏈進入人體而富集［2］。微量的五氯酚鈉即對人體有毒，可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、肝、腎損傷及內(nèi)分泌紊亂。五氯酚鈉性質(zhì)較穩(wěn)定，易富集于沉淀物中，在動植物體內(nèi)富集率高，可以通過人畜呼吸道、消化道、皮膚接觸等進入機體。在體內(nèi)五氯酚鈉轉(zhuǎn)變?yōu)槲迓确?，五氯酚具有有機氯和酚的毒性，會對人畜產(chǎn)生急慢性毒害。美國環(huán)境保護署(EPA)已經(jīng)將五氯酚鈉列為可疑致癌物質(zhì)，并限制其使用。中國農(nóng)業(yè)部也已禁止在水生動物養(yǎng)殖中使用五氯酚鈉。但目前仍有一些養(yǎng)殖戶在水產(chǎn)養(yǎng)殖中非法使用五氯酚鈉，在2010年農(nóng)業(yè)部第一、二次產(chǎn)地水產(chǎn)品質(zhì)量抽檢中仍能檢測出五氯酚鈉。因此，研究五氯酚鈉在淡水魚體內(nèi)藥代動力學(xué)規(guī)律及殘留的檢測方法，將有助于進一步規(guī)范進而杜絕該藥物在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的非法使用。

目前，國內(nèi)外對五氯苯酚及其鈉鹽在土壤［3］、水體［4－5］、木材［6］、皮革［7］、紡織品［8］、蜂蜜［9］、尿［10］中殘留的研究相對較多，而對其在動物組織中殘留的研究較少，對五氯酚鈉在水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律及殘留的研究尚未見報道。為此，本研究中，作者以鯽Carassius auratus為試驗對象，研究了五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的毒性及代謝動力學(xué)規(guī)律，旨在建立一種完整、準(zhǔn)確的揭示五氯酚鈉在水產(chǎn)動物體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鯽 試驗用鯽購自上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場，體質(zhì)量為 (22±2)g。試驗前先在室內(nèi)常規(guī)飼喂2周，然后挑選體表完整、健康活潑、無病無傷的個體用于毒性試驗，為了確定藥物濃度的大概范圍，正式試驗前先進行預(yù)試驗。養(yǎng)殖場地為上海市水產(chǎn)研究所內(nèi)的玻璃養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖規(guī)模根據(jù)試驗要求預(yù)先進行設(shè)計。試驗用水為曝氣7 d以上的自來水，相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試驗藥品及儀器 試驗藥品有五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，購自Sigma公司;五氯酚鈉原料藥，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，購自上海富庶化工有限公司;正己烷為HPLC級;其他試劑均為市售分析純。

試驗儀器有PL202－S電子天平 (METTLER)、MSI Minishaker型震蕩器 (IKA)、Eppendorf 5810R離心機、Agilent GC6890氣相色譜儀 (配63Ni微電子捕獲檢測器μECD)。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗 挑選健康活潑、大小均勻的鯽70尾，分為7組，每組10尾，采用6個濃度梯度和1個對照進行預(yù)試驗［11］。試驗采用常溫靜水模式，時間為96 h，根據(jù)試驗結(jié)果確定該種藥物對試驗魚的最高安全濃度［12］。如果該濃度范圍無法確定，則另選一個濃度范圍進行試驗，以確定試驗所需的最高安全濃度。將試驗藥物配成母液，再按比例稀釋成濃度為0(對照)、1、2、3、4、5、10 mg/L，將試驗魚從低濃度到高濃度逐個放入。試驗期間不喂餌，將死亡的魚及時撈出，并放入清水中，5 min不動為死亡。試驗開始后，連續(xù)觀察各濃度下試驗魚的異常行為、體表變化等，記錄死亡和存活數(shù)量。

1.2.2 藥代動力學(xué)試驗 挑選健康活潑、大小均勻的鯽100尾用于試驗。將試驗魚在藥物濃度為2 mg/L的水溶液中浸浴24 h后，轉(zhuǎn)入清水玻璃池中飼養(yǎng)，水溫為 (25±0.5)℃，pH為7.0～8.0。分別于藥浴后的 0、2、4、8、12 h和 1、2、3、5、7、8、10、12、14、21、28、35、42、49、63、70 d隨機取樣3～5尾，從心臟取血，置于肝素化的離心管中，將血樣與肌肉等組織均置于冰箱 (－40℃)中保存，待測。

1.2.3 樣品處理

1)血漿樣品的處理。準(zhǔn)確吸取100 μL樣品，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的硫酸溶液中，渦旋1 min后，在80℃的水浴中溫浴30 min，冷卻至室溫;加入1 mL正己烷，充分渦旋2 min，離心;取正己烷提取液于另一離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機層。在正己烷提取液中加入2 mL 0.1 mol/mL的 K2CO3溶液，渦旋2 min，離心;吸取K2CO3溶液層于另一離心管中，再用2 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次，合并K2CO3提取液。將0.1 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中，渦旋2 min并不斷放氣，加1 mL正己烷提取兩次，合并正己烷層，用1.0 g無水Na2SO4脫水，待測。

2)肌肉樣品的處理。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于具塞試管中，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的硫酸溶液，渦旋1 min后，在80℃的水浴中溫浴30 min，冷卻至室溫，加入10 mL正己烷，充分渦旋2 min，離心;取正己烷提取液于另一離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機層。在正己烷提取液中加入4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液，渦旋2 min，離心;吸取K2CO3溶液層于另一離心管中，再用4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次，合并K2CO3提取液。將0.2 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中，渦旋2 min并不斷放氣，加2.5 mL正己烷提取兩次，合并正己烷層，定容至5.0 mL，用2.0 g無水Na2SO4脫水，待測。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率 準(zhǔn)確稱取20.20 mg五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L K2CO3溶液溶解，定容至100 mL，濃度為200 μg/mL，于4℃下保存。將上述溶液稀釋配制成0.03、1、2、5、10、50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各吸取1 mL，處理步驟同樣品處理方法，進行氣相色譜測定，繪制“色譜峰面積/五氯酚鈉濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白對照組鯽血漿100 μL，準(zhǔn)確加入一定量的五氯酚鈉溶液，配制成五氯酚鈉濃度分別為2、20、100 ng/mL的血漿樣品，按前述血樣處理方法處理，用氣相色譜測定。取空白對照組鯽肌肉1.0 g，準(zhǔn)確加入一定量的五氯酚鈉溶液，配制成五氯酚鈉濃度分別為2、20、100 ng/mL的肌肉樣品，按前述肌肉樣品處理方法，用氣相色譜測定?；厥章蕿槊總€測得濃度占實際濃度的百分比。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為DB－35MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為300℃;柱溫為140℃ (保留2 min)，以10℃/min的升溫速度升至200℃ (保留7 min)，再升至 260℃ (保留 3 min);載氣為99.999%的高純氦氣，流量為1.2 mL/min，線速度為29 cm/s;尾吹氣為99.999%的高純氮氣，流量為60.0 mL/min;進樣量為1 μL，進樣方式為不分流進樣，吹掃放空時間為0.75 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率

按照本試驗的方法，五氯苯酚在0.03～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，用回歸分析法對數(shù)據(jù)進行分析處理，以一定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=144.2 x+193.5，r=0.9992。在本試驗條件下，用氣相色譜法測得五氯酚鈉在鯽血漿和肌肉中的回收率分別為92.2%±4.15%、88.7%±6.32%。

2.2 毒性試驗

五氯酚鈉濃度為10 mg/L時，試驗魚剛放入藥液中就表現(xiàn)出煩躁的特征，具體為快速游動，反應(yīng)激烈，10 min即出現(xiàn)失去平衡現(xiàn)象，1 h后試驗魚100%死亡;當(dāng)五氯酚鈉濃度為3 mg/L時，1 h后試驗魚有10%死亡，2 h后試驗魚有40%死亡，8 h后試驗魚100%死亡;當(dāng)五氯酚鈉濃度為2 mg/L時，試驗魚健康存活，96 h時無死亡現(xiàn)象 (表1)。試驗結(jié)果表明，五氯酚鈉可以很快被試驗魚吸收，對試驗魚的毒性作用非常迅速。

表1 五氯酚鈉對鯽的毒性試驗Tab.1 Acute toxicity of sodium pentachlorophenol to crucian carp Carassius auratus

2.3 藥代動力學(xué)

將試驗魚在濃度為2 mg/L的五氯酚鈉水溶液中浸浴24 h后，于不同時間段采樣，將樣品處理后經(jīng)氣相色譜分析，藥物在鯽血漿和肌肉中的藥動學(xué)曲線如圖1所示。藥物在血漿中的動力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，五氯酚鈉在鯽血漿中的血藥濃度參數(shù)符合一室模型，其主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0－t、Tmax、MRT0－t分別為 12.0 ng/mL、943.3 ng/(mL·h)、1 h、264.7 h，藥物迅速被鯽吸收，在0.5 h就能達(dá)到11.5 ng/mL，1 h達(dá)到峰值12.0 ng/mL，與毒性試驗結(jié)果相符。但藥物的代謝較慢，在藥浴49 d后血漿中仍能檢測到藥物 (濃度為0.033 ng/mL)，直到70 d后才檢測不到藥物。

藥物在鯽肌肉中的動力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，五氯酚鈉在鯽肌肉中的藥動學(xué)參數(shù)符合二室模型，其主要 藥 動 學(xué) 參 數(shù) t1/2α、 t1/2β、 MRT0－t、 Tmax、 Cmax、AUC0－t、MAT 分別為12.6 h、186.8 h、260.4 h、1 h、11.84 ng/mL、1106.5 ng/(mL·h)、222.5 h，藥物在肌肉中的分布與在血漿中類似，迅速被鯽吸收，1 h達(dá)到峰值11.84 ng/mL，比血漿中的峰濃度略低。藥物在肌肉中的代謝比血漿中略慢，可能是由于血漿中的藥物與血漿蛋白結(jié)合而使代謝加快。

圖1 五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的藥動學(xué)曲線 (mean±S.D.，n=3)Fig.1 Pharmacokinetic profile of sodium pentachlorophenol in crucian carp Carassius auratus

3 討論

五氯酚鈉作為一種非選擇性接觸型除蟲、除草、清塘藥物，對魚類的急性毒害作用較大。本試驗結(jié)果表明，五氯酚鈉濃度為3 mg/L時，8 h后試驗魚就100%死亡，遠(yuǎn)小于潘建林等［13］報道的克氏原螯蝦對五氯酚鈉的耐受力，與盧玲等［14］報道的五氯苯酚對劍尾魚和稀有鯽的毒性試驗相符;五氯酚鈉對試驗魚的安全濃度為2 mg/L，96 h無死亡現(xiàn)象。在實際應(yīng)用中，必須慎用五氯酚鈉，以防止對魚類造成危害，進而進入市場危害人民群眾的身體健康。藥代謝動力學(xué)的試驗結(jié)果表明，五氯酚鈉可被鯽迅速吸收，在血漿中的血藥濃度參數(shù)符合一室模型，1 h后即可達(dá)到最高藥物濃度 (12.0 ng/mL)，在肌肉中的藥動參數(shù)符合二室模型，且達(dá)到峰值時間與血液基本一致，肌肉中藥物峰濃度比血液中略低，推測可能是由于五氯酚鈉在血液和肌肉中的交換速率不同，而交換速率與血流量有關(guān)，二者具有動態(tài)同步性。藥物在血液和肌肉中的代謝都比較慢，給藥70 d后在血液中才檢測不到藥物。與五氯酚鈉在肌肉中的代謝相比，藥物在血液中的代謝稍快。推測可能是由于藥物進入血液后，部分藥物與血漿蛋白結(jié)合成為結(jié)合型藥物，部分藥物呈游離型，經(jīng)門靜脈進入肝臟，經(jīng)肝內(nèi)藥物代謝酶作用，使血漿中藥物濃度迅速降低，從而使其在血液中的代謝加快。

［1］Agency for toxic substances and disease registry.Toxicological profile for pentachlorophenol［M］.Atlanta:Public Health Service，U.S.Department of Health and Human Services，1999.

［2］Gagnon M M.Metabolic disturbances in fish exposed to sodium pentachlorophenate(NaPCP)and 3，3'，4，4'，5－pentachlorophenyl(PCB126)，individually or combined ［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，2002，132:425－435.

［3］Luciana P，Lúcia R M.Methods for determination of hexachlo－robenzene and pentachlorophenol in soil samples［J］.Talanta，1998，46(5):915－920.

［4］Anna O，David P，Jordi G，et al.Determination of pentachlorophenol in certified waste waters，soil samples and industrial effluents using ELISA and liquid solid extraction followed by liquid chromatography［J］.Analytica Chimica Acta，1997，346(1):49－59.

［5］Turnes M I，Mejuto M C，Cela R.Determination of pentachlorophenol in water samples by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，1996，733(1):395－404.

［6］Roland B，Hans－Cerhard B，Win Tin.Determination of pentachlo－－rophenol(PCP)in waste wood－method comparison by a collaborative trial［J］.Chemosphere，2002，47(9):1001－1006.

［7］SN 019311－93出口皮革及皮革制品中五氯酚殘留量檢測方法乙?；瘹庀嗌V法［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1993.

［8］GB/T 1841412－2001紡織品五氯苯酚殘留量的測定第2部分:氣相色譜法［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

［9］Fernández M M A，Simal L J.Mass spectrometric determination of pentachlorophenol in honey［J］.Analytica Chimica Acta，1991，247(1):121－123.

［10］Bartels P，Ebeling E，Kramer B，et al.Determination of chlorophenols in urine of children and suggestion of reference values［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，1999，365(5):458－464.

［11］周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1989.

［12］丁淑荃，萬全，范文張，等.五種藥物對花魚骨魚苗的急性毒性試驗［J］.淡水漁業(yè)，2006，36(5):48－51.

［13］潘建林，宋勝磊，唐建清，等.五氯酚鈉對克氏原螯蝦急性毒性試驗［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2005，24(1):60－63.

［14］盧玲，沈英娃.酚類、烷基苯類、硝基苯類化合物和環(huán)境水樣對劍尾魚和稀有鮈鯽的急性毒性［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2002，15(4):57－59.