五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的毒性及代謝動(dòng)力學(xué)的研究

李磊，黃清發(fā)，肖雨，孫建華，戚雋淵，孫振中

(上海市水產(chǎn)研究所上海市水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海200433)

五氯酚鈉 (Sodium pentachlorophenol，PCP)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)中，如作為除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑以及木材防腐處理等，在中國(guó)主要用它來(lái)進(jìn)行池塘滅螺［1］。五氯酚鈉具有良好的水溶性，在自然界中降解緩慢，若長(zhǎng)期使用，會(huì)造成環(huán)境污染，殘留的五氯酚鈉還能通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體而富集［2］。微量的五氯酚鈉即對(duì)人體有毒，可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、肝、腎損傷及內(nèi)分泌紊亂。五氯酚鈉性質(zhì)較穩(wěn)定，易富集于沉淀物中，在動(dòng)植物體內(nèi)富集率高，可以通過(guò)人畜呼吸道、消化道、皮膚接觸等進(jìn)入機(jī)體。在體內(nèi)五氯酚鈉轉(zhuǎn)變?yōu)槲迓确?，五氯酚具有有機(jī)氯和酚的毒性，會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生急慢性毒害。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已經(jīng)將五氯酚鈉列為可疑致癌物質(zhì)，并限制其使用。中國(guó)農(nóng)業(yè)部也已禁止在水生動(dòng)物養(yǎng)殖中使用五氯酚鈉。但目前仍有一些養(yǎng)殖戶在水產(chǎn)養(yǎng)殖中非法使用五氯酚鈉，在2010年農(nóng)業(yè)部第一、二次產(chǎn)地水產(chǎn)品質(zhì)量抽檢中仍能檢測(cè)出五氯酚鈉。因此，研究五氯酚鈉在淡水魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律及殘留的檢測(cè)方法，將有助于進(jìn)一步規(guī)范進(jìn)而杜絕該藥物在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的非法使用。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)五氯苯酚及其鈉鹽在土壤［3］、水體［4－5］、木材［6］、皮革［7］、紡織品［8］、蜂蜜［9］、尿［10］中殘留的研究相對(duì)較多，而對(duì)其在動(dòng)物組織中殘留的研究較少，對(duì)五氯酚鈉在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律及殘留的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究中，作者以鯽Carassius auratus為試驗(yàn)對(duì)象，研究了五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的毒性及代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律，旨在建立一種完整、準(zhǔn)確的揭示五氯酚鈉在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鯽 試驗(yàn)用鯽購(gòu)自上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場(chǎng)，體質(zhì)量為 (22±2)g。試驗(yàn)前先在室內(nèi)常規(guī)飼喂2周，然后挑選體表完整、健康活潑、無(wú)病無(wú)傷的個(gè)體用于毒性試驗(yàn)，為了確定藥物濃度的大概范圍，正式試驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。養(yǎng)殖場(chǎng)地為上海市水產(chǎn)研究所內(nèi)的玻璃養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖規(guī)模根據(jù)試驗(yàn)要求預(yù)先進(jìn)行設(shè)計(jì)。試驗(yàn)用水為曝氣7 d以上的自來(lái)水，相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品及儀器 試驗(yàn)藥品有五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，購(gòu)自Sigma公司;五氯酚鈉原料藥，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，購(gòu)自上海富庶化工有限公司;正己烷為HPLC級(jí);其他試劑均為市售分析純。

試驗(yàn)儀器有PL202－S電子天平 (METTLER)、MSI Minishaker型震蕩器 (IKA)、Eppendorf 5810R離心機(jī)、Agilent GC6890氣相色譜儀 (配63Ni微電子捕獲檢測(cè)器μECD)。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗(yàn) 挑選健康活潑、大小均勻的鯽70尾，分為7組，每組10尾，采用6個(gè)濃度梯度和1個(gè)對(duì)照進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)［11］。試驗(yàn)采用常溫靜水模式，時(shí)間為96 h，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定該種藥物對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的最高安全濃度［12］。如果該濃度范圍無(wú)法確定，則另選一個(gè)濃度范圍進(jìn)行試驗(yàn)，以確定試驗(yàn)所需的最高安全濃度。將試驗(yàn)藥物配成母液，再按比例稀釋成濃度為0(對(duì)照)、1、2、3、4、5、10 mg/L，將試驗(yàn)魚(yú)從低濃度到高濃度逐個(gè)放入。試驗(yàn)期間不喂餌，將死亡的魚(yú)及時(shí)撈出，并放入清水中，5 min不動(dòng)為死亡。試驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)觀察各濃度下試驗(yàn)魚(yú)的異常行為、體表變化等，記錄死亡和存活數(shù)量。

1.2.2 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 挑選健康活潑、大小均勻的鯽100尾用于試驗(yàn)。將試驗(yàn)魚(yú)在藥物濃度為2 mg/L的水溶液中浸浴24 h后，轉(zhuǎn)入清水玻璃池中飼養(yǎng)，水溫為 (25±0.5)℃，pH為7.0～8.0。分別于藥浴后的 0、2、4、8、12 h和 1、2、3、5、7、8、10、12、14、21、28、35、42、49、63、70 d隨機(jī)取樣3～5尾，從心臟取血，置于肝素化的離心管中，將血樣與肌肉等組織均置于冰箱 (－40℃)中保存，待測(cè)。

1.2.3 樣品處理

1)血漿樣品的處理。準(zhǔn)確吸取100 μL樣品，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的硫酸溶液中，渦旋1 min后，在80℃的水浴中溫浴30 min，冷卻至室溫;加入1 mL正己烷，充分渦旋2 min，離心;取正己烷提取液于另一離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機(jī)層。在正己烷提取液中加入2 mL 0.1 mol/mL的 K2CO3溶液，渦旋2 min，離心;吸取K2CO3溶液層于另一離心管中，再用2 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次，合并K2CO3提取液。將0.1 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中，渦旋2 min并不斷放氣，加1 mL正己烷提取兩次，合并正己烷層，用1.0 g無(wú)水Na2SO4脫水，待測(cè)。

2)肌肉樣品的處理。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g樣品于具塞試管中，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的硫酸溶液，渦旋1 min后，在80℃的水浴中溫浴30 min，冷卻至室溫，加入10 mL正己烷，充分渦旋2 min，離心;取正己烷提取液于另一離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機(jī)層。在正己烷提取液中加入4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液，渦旋2 min，離心;吸取K2CO3溶液層于另一離心管中，再用4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次，合并K2CO3提取液。將0.2 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中，渦旋2 min并不斷放氣，加2.5 mL正己烷提取兩次，合并正己烷層，定容至5.0 mL，用2.0 g無(wú)水Na2SO4脫水，待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率 準(zhǔn)確稱(chēng)取20.20 mg五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L K2CO3溶液溶解，定容至100 mL，濃度為200 μg/mL，于4℃下保存。將上述溶液稀釋配制成0.03、1、2、5、10、50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各吸取1 mL，處理步驟同樣品處理方法，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，繪制“色譜峰面積/五氯酚鈉濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白對(duì)照組鯽血漿100 μL，準(zhǔn)確加入一定量的五氯酚鈉溶液，配制成五氯酚鈉濃度分別為2、20、100 ng/mL的血漿樣品，按前述血樣處理方法處理，用氣相色譜測(cè)定。取空白對(duì)照組鯽肌肉1.0 g，準(zhǔn)確加入一定量的五氯酚鈉溶液，配制成五氯酚鈉濃度分別為2、20、100 ng/mL的肌肉樣品，按前述肌肉樣品處理方法，用氣相色譜測(cè)定。回收率為每個(gè)測(cè)得濃度占實(shí)際濃度的百分比。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為DB－35MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為300℃;柱溫為140℃ (保留2 min)，以10℃/min的升溫速度升至200℃ (保留7 min)，再升至 260℃ (保留 3 min);載氣為99.999%的高純氦氣，流量為1.2 mL/min，線速度為29 cm/s;尾吹氣為99.999%的高純氮?dú)猓髁繛?0.0 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，吹掃放空時(shí)間為0.75 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率

按照本試驗(yàn)的方法，五氯苯酚在0.03～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，用回歸分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以一定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=144.2 x+193.5，r=0.9992。在本試驗(yàn)條件下，用氣相色譜法測(cè)得五氯酚鈉在鯽血漿和肌肉中的回收率分別為92.2%±4.15%、88.7%±6.32%。

2.2 毒性試驗(yàn)

五氯酚鈉濃度為10 mg/L時(shí)，試驗(yàn)魚(yú)剛放入藥液中就表現(xiàn)出煩躁的特征，具體為快速游動(dòng)，反應(yīng)激烈，10 min即出現(xiàn)失去平衡現(xiàn)象，1 h后試驗(yàn)魚(yú)100%死亡;當(dāng)五氯酚鈉濃度為3 mg/L時(shí)，1 h后試驗(yàn)魚(yú)有10%死亡，2 h后試驗(yàn)魚(yú)有40%死亡，8 h后試驗(yàn)魚(yú)100%死亡;當(dāng)五氯酚鈉濃度為2 mg/L時(shí)，試驗(yàn)魚(yú)健康存活，96 h時(shí)無(wú)死亡現(xiàn)象 (表1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，五氯酚鈉可以很快被試驗(yàn)魚(yú)吸收，對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的毒性作用非常迅速。

表1 五氯酚鈉對(duì)鯽的毒性試驗(yàn)Tab.1 Acute toxicity of sodium pentachlorophenol to crucian carp Carassius auratus

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)

將試驗(yàn)魚(yú)在濃度為2 mg/L的五氯酚鈉水溶液中浸浴24 h后，于不同時(shí)間段采樣，將樣品處理后經(jīng)氣相色譜分析，藥物在鯽血漿和肌肉中的藥動(dòng)學(xué)曲線如圖1所示。藥物在血漿中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，五氯酚鈉在鯽血漿中的血藥濃度參數(shù)符合一室模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0－t、Tmax、MRT0－t分別為 12.0 ng/mL、943.3 ng/(mL·h)、1 h、264.7 h，藥物迅速被鯽吸收，在0.5 h就能達(dá)到11.5 ng/mL，1 h達(dá)到峰值12.0 ng/mL，與毒性試驗(yàn)結(jié)果相符。但藥物的代謝較慢，在藥浴49 d后血漿中仍能檢測(cè)到藥物 (濃度為0.033 ng/mL)，直到70 d后才檢測(cè)不到藥物。

藥物在鯽肌肉中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，五氯酚鈉在鯽肌肉中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)符合二室模型，其主要 藥 動(dòng) 學(xué) 參 數(shù) t1/2α、 t1/2β、 MRT0－t、 Tmax、 Cmax、AUC0－t、MAT 分別為12.6 h、186.8 h、260.4 h、1 h、11.84 ng/mL、1106.5 ng/(mL·h)、222.5 h，藥物在肌肉中的分布與在血漿中類(lèi)似，迅速被鯽吸收，1 h達(dá)到峰值11.84 ng/mL，比血漿中的峰濃度略低。藥物在肌肉中的代謝比血漿中略慢，可能是由于血漿中的藥物與血漿蛋白結(jié)合而使代謝加快。

圖1 五氯酚鈉在鯽體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)曲線 (mean±S.D.，n=3)Fig.1 Pharmacokinetic profile of sodium pentachlorophenol in crucian carp Carassius auratus

3 討論

五氯酚鈉作為一種非選擇性接觸型除蟲(chóng)、除草、清塘藥物，對(duì)魚(yú)類(lèi)的急性毒害作用較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，五氯酚鈉濃度為3 mg/L時(shí)，8 h后試驗(yàn)魚(yú)就100%死亡，遠(yuǎn)小于潘建林等［13］報(bào)道的克氏原螯蝦對(duì)五氯酚鈉的耐受力，與盧玲等［14］報(bào)道的五氯苯酚對(duì)劍尾魚(yú)和稀有鯽的毒性試驗(yàn)相符;五氯酚鈉對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的安全濃度為2 mg/L，96 h無(wú)死亡現(xiàn)象。在實(shí)際應(yīng)用中，必須慎用五氯酚鈉，以防止對(duì)魚(yú)類(lèi)造成危害，進(jìn)而進(jìn)入市場(chǎng)危害人民群眾的身體健康。藥代謝動(dòng)力學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果表明，五氯酚鈉可被鯽迅速吸收，在血漿中的血藥濃度參數(shù)符合一室模型，1 h后即可達(dá)到最高藥物濃度 (12.0 ng/mL)，在肌肉中的藥動(dòng)參數(shù)符合二室模型，且達(dá)到峰值時(shí)間與血液基本一致，肌肉中藥物峰濃度比血液中略低，推測(cè)可能是由于五氯酚鈉在血液和肌肉中的交換速率不同，而交換速率與血流量有關(guān)，二者具有動(dòng)態(tài)同步性。藥物在血液和肌肉中的代謝都比較慢，給藥70 d后在血液中才檢測(cè)不到藥物。與五氯酚鈉在肌肉中的代謝相比，藥物在血液中的代謝稍快。推測(cè)可能是由于藥物進(jìn)入血液后，部分藥物與血漿蛋白結(jié)合成為結(jié)合型藥物，部分藥物呈游離型，經(jīng)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，經(jīng)肝內(nèi)藥物代謝酶作用，使血漿中藥物濃度迅速降低，從而使其在血液中的代謝加快。

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