飼料中β－胡蘿卜素和蝦青素添加量對(duì)仿刺參幼參生長及抗氧化能力的影響

王吉橋，樊瑩瑩，徐振祥，張凱，叢文虎，劉春寶，吳巖強(qiáng)，張劍誠

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2.大連金砣水產(chǎn)食品有限公司，遼寧大連116400;3.大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司，遼寧大連116000)

改善水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化系統(tǒng)，提高機(jī)體抵御氧化損傷能力一直是研究的熱點(diǎn)之一。雖然已有研究成功運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高了銀大馬哈魚Oncorhynchus kisutch［1］等水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化酶活性，但是，更多的研究是采用飼料中添加抗氧化劑的營養(yǎng)調(diào)控方式。在飼料中添加抗氧化劑不僅能顯著提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力，而且在一定程度上還能促進(jìn)動(dòng)物的生長;此外，還可保護(hù)飼料中的還原成分，減少營養(yǎng)損失，使飼料品質(zhì)更加穩(wěn)定。目前，應(yīng)用較為廣泛的抗氧化劑主要有谷胱甘肽 (glutathione，GSH)、硒、維生素A、維生素C、維生素E及類胡蘿卜素等［2－3］。

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，目前研究較多且具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和重要生物學(xué)功能的類胡蘿卜素約有50多種，其中β－胡蘿卜素、蝦青素因效果好、易獲得等原因，已作為天然抗氧化劑被廣泛用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的飼養(yǎng)中。但有關(guān)飼料中添加β－胡蘿卜素、蝦青素對(duì)仿刺參Apostichopus japonicus生長和抗氧化能力影響方面的研究目前尚未見報(bào)道。為此，作者在飼料中分別添加不同劑量的β－胡蘿卜素和蝦青素，探討促進(jìn)仿刺參生長及抗氧化能力的適宜劑量，以豐富仿刺參研究的營養(yǎng)學(xué)內(nèi)容，為科學(xué)配制仿刺參飼料，提高其養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 仿刺參在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)兩周后，挑選大小均勻、體質(zhì)健壯的幼參315頭，隨機(jī)分成7組，分別放入容器為60 L(50 cm×40 cm×30 cm)的硬質(zhì)塑料水槽中，每槽放15頭。其中3組投喂添加30、60、90 mg/kg β－胡蘿卜素的飼料，記為 A、B、C組;3組投喂添加 30、60、90 mg/kg蝦青素的飼料，記為D、E、F組，對(duì)照組(G組)投喂不添加任何類胡蘿卜素的基礎(chǔ)飼料。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)共進(jìn)行80 d，分4個(gè)階段，每個(gè)階段20 d。試驗(yàn)期間，自然光照，水箱內(nèi)24 h充氣，水溫為11.0～20.0℃，鹽度為35，pH為7.5左右。隔天換水1/3～1/2。換水當(dāng)天17:00投喂，開始時(shí)投喂量為幼參體質(zhì)量的3.0%，隨著仿刺參的生長投喂量逐漸增大，略過量投喂。投喂時(shí)將糊狀飼料均勻涂抹在波紋板上，放在水槽底部，涂抹飼料面朝上，將充氣石壓在板下。仿刺參攝食后排出的糞便呈規(guī)則的長條狀，不分散，利于殘餌和糞便的辨別和收集。

1.2.2 試驗(yàn)飼料配方 (均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))及配制基礎(chǔ)飼料配方為:魚粉11.0%、蝦糠5.0%、海泥40.0%、貝殼粉5.0%、豆粕7.0%、酵母1.0%、電解維他0.8%、南瓜粉3.75%、木瓜粉3.75%、紅薯粉3.75%、馬鈴薯粉3.75%、芋頭粉10.0%、紅棗粉2.0%、山藥粉3.0%，并添加0.2%黃原膠作為增稠劑?；A(chǔ)飼料含粗蛋白18.7%，粗脂肪1.61%，粗灰分54.29%。

將混合陸生植物粉 (南瓜粉、木瓜粉、紅薯粉、馬鈴薯粉、山藥粉、紅棗粉、芋頭粉)在120℃的高壓鍋內(nèi)糊化15 min，烘干，研磨、粉碎。飼料中所有原料均經(jīng)粉碎機(jī)粉碎并用100目篩絹過濾，混合均勻，制成粉狀混合物。

1.2.3 測定項(xiàng)目與方法 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)取20頭仿刺參，用1 mL注射器從仿刺參體后部抽取體腔液后，迅速注入已放置在冰盒中的1.5 mL離心管中，以3000 r/min冷凍離心15 min，取上清液在－20℃下保存，用于體腔液中總抗氧化能力和抗氧化酶活力的測定;將各組所有仿刺參解剖，分離體壁、內(nèi)臟并用過濾海水沖洗，每組留約30 g體壁，并與全部腸道組織在－20℃下保存，用于體壁成分、腸道消化酶活力的測定。

分別采用凱氏定氮法、105℃恒溫干燥法、索氏抽提法 (以無水乙醚為抽提液)和高溫灼燒法對(duì)飼料和仿刺參體壁中粗蛋白、水分、粗脂肪和粗灰分的含量進(jìn)行測定。

按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒中的方法處理樣品，并對(duì)仿刺參體腔液中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)活力和總抗氧化能力 (T－AOC)及腸道中蛋白酶、淀粉酶活力進(jìn)行測定與計(jì)算。

蛋白酶活力定義:在37℃下每毫克組織蛋白每分鐘水解生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個(gè)酶活力單位，以U/mg表示。

淀粉酶活力定義:在37℃下每毫克組織蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位，以U/mg表示。

從圖2可知，伍姓湖最高水位345.96m時(shí)，湖水容積為3.05×107m3，表面積為21.7km2，最低水位343.85 m時(shí)，湖水容積為 0.38×107m3，表面積為 9.6 km2。

在試驗(yàn)的第20、40、60、80天，用經(jīng)海水浸泡、擰至半干的醫(yī)用紗布吸干仿刺參體表的海水，用電子天平稱量 (精確至0.01 g)各水槽中仿刺參的總質(zhì)量，計(jì)算特定生長率:

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±S.E.表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)、方差分析和LSD多重比較，以P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 仿刺參攝食添加β－胡蘿卜素和蝦青素飼料時(shí)的特定生長率

從表1可見:在整個(gè)試驗(yàn)期間，攝食添加β－胡蘿卜素的仿刺參的特定生長率隨添加量的增加而升高，A、B、C組分別比對(duì)照組提高 6.67%、73.33%和100.0%，但僅C組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05);攝食添加蝦青素的仿刺參的特定生長率不隨添加量的增加而升高，添加60 mg/kg(E組)和90 mg/kg蝦青素 (F組)的仿刺參特定生長率比對(duì)照組提高113.33%和66.67%，但僅E組與對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)。這表明飼料中添加β－胡蘿卜素和蝦青素都能促進(jìn)仿刺參的生長，但所需含量不同:β－胡蘿卜素為90 mg/kg，蝦青素為60 mg/kg，即蝦青素的促生長效果要優(yōu)于β－胡蘿卜素。

在試驗(yàn)的不同時(shí)期，攝食不同試驗(yàn)飼料的仿刺參生長速度也不同，呈“低—高—低”的變化趨勢(shì)。從圖1可見:試驗(yàn)初期 (第20天)，仿刺參對(duì)試驗(yàn)飼料和飼養(yǎng)環(huán)境不完全適應(yīng)，生長速度呈負(fù)值;第二飼養(yǎng)階段 (第40天)，水溫逐漸升高，仿刺參生長速度加快，攝食添加β－胡蘿卜素和蝦青素飼料的仿刺參的特定生長率均高于對(duì)照組 (P＞0.05)，且隨飼料中β－胡蘿卜素和蝦青素含量的增加而升高;第三飼養(yǎng)階段 (第60 d)，水溫在適宜的上限，仿刺參生長速度加快，攝食添加β－胡蘿卜素和蝦青素飼料的仿刺參的特定生長率均高于對(duì)照組 (P＞0.05)，且隨飼料中β－胡蘿卜素含量的增加而升高，但不隨蝦青素含量的增加而升高，其中E組仿刺參的特定生長率最大;第四飼養(yǎng)階段 (第80天)，水溫升高至19.0～20.0℃，仿刺參的生長速度慢于第二、三階段，但仍高于對(duì)照組，其中僅D組、E組仿刺參的生長速度顯著快于對(duì)照組 (P＜0.05)。

表1 攝食不同飼料的仿刺參的生長Tab.1 Specific growth rate in the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of β－carotene and astaxanthins

圖1 攝食不同飼料的仿刺參在不同試驗(yàn)階段的生長Fig.1 Specific growth rate in the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of βcarotene and astaxanthins at various experimental periods

從總體來看 (表 1)，E組 (蝦青素 60 mg/kg)仿刺參的生長速度最快，特定生長率為0.32%/d，其次是C組 (β－胡蘿卜素90 mg/kg)，為0.30%/d。將飼料中β－胡蘿卜素和蝦青素添加量相同的各組分別進(jìn)行比較，E組的特定生長率顯著高于B組 (P＜0.05)，C組顯著高于F組 (P＜0.05)，但A組與D組差異不顯著 (P＞0.05)。

2.2 攝食不同飼料的仿刺參腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性

從表2可見:攝食含不同劑量β－胡蘿卜素和蝦青素飼料的仿刺參腸道中蛋白酶和淀粉酶活力分別為59.53～61.47 U/mg和6.31～8.67 U/mg，與添加劑量沒有明顯的相關(guān)關(guān)系，各組間差異均不顯著 (P＞0.05)。

2.3 攝食不同飼料的仿刺參體腔液中的總抗氧化能力

2.3.1 總抗氧化能力 (T－AOC) 從表2可見:試驗(yàn)組仿刺參體腔液中的總抗氧化能力 (T－AOC)隨飼料中β－胡蘿卜素和蝦青素含量的增加而升高，其中A、B、C組仿刺參體腔液中的T－AOC分別比對(duì)照組提高13.39%、19.40%和26.78%，僅C組顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);D、E、F組的TAOC分別比對(duì)照組提高38.25%、90.30% 和94.95%，均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。飼料中添加蝦青素的各組仿刺參體腔液中的平均總抗氧化能力為12.77 U/mL，比添加β－胡蘿卜素的各組(平均8.77 U/mL)高45.61%，表明蝦青素的總抗氧化能力要優(yōu)于β－胡蘿卜素。

表2 攝食不同飼料的仿刺參腸道中的消化酶活性和體腔液中的總抗氧化能力Tab.2 Digestive enzyme activities in the intestine，and total antioxidation capacity in the coelomic fluid of the sea cucumber fed different diets

2.3.2 抗氧化酶活力 仿刺參體腔液中的SOD和CAT活力因飼料中添加的類胡蘿卜素種類及其劑量不同而異。從圖2可見:C、E、F組仿刺參體腔液中的SOD、CAT活力均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，而A、B、D組與對(duì)照組差異均不顯著 (P＞0.05);飼料中添加β－胡蘿卜素的各組中，C組的SOD和CAT活力最低，且顯著低于A組、B組(P＜0.05);飼料中添加蝦青素的各組中，E組、F組的SOD和CAT活力較低，均顯著低于D組 (P＜0.05)。在相同添加量下，攝食含蝦青素飼料的各組仿刺參體腔液中的SOD和CAT活力均低于攝食添加β－胡蘿卜素的各組，但只有添加量為60 mg/kg的B組與E組間的SOD和CAT活力差異顯著 (P＜0.05)，其余添加量相同的組間差異均不顯著 (P＞0.05)。

圖2 攝食不同飼料的仿刺參體腔液中的抗氧化酶活力Fig.2 The antioxidative enzyme activities in the coelomic fluid of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of β－carotene and astaxanthins

2.4 攝食不同飼料的仿刺參體壁的成分

從表3可見，攝食添加β－胡蘿卜素和蝦青素飼料的仿刺參體壁中粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量分別為50.87%～51.11%、5.46%～5.70%和29.57%～30.06%，各組間差異均不顯著 (P＞0.05)。

表3 攝食不同飼料的仿刺參體壁干物質(zhì)的成分Tab.3 The approximate composition in the body wall of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of β－carotene and astaxanthins

3 討論

3.1 β－胡蘿卜素和蝦青素對(duì)仿刺參生長的影響

目前，有關(guān)類胡蘿卜素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的促生長作用的研究結(jié)果不盡相同。用分別添加蝦青素和富含類胡蘿卜素的雨生紅球藻Haematococcus pluvialis飼喂日本囊對(duì)蝦 Marsupenaeus japonicus［4］，用添加蝦青素的飼料飼喂紅螯螯蝦Cherax quadricarinatus［5］，用添加蝦青素的飼料飼喂虹鱒Oncorhynchus mykiss［6］，用分別添加蝦青素和角黃素的飼料飼喂虹鱒［7－8］，其生長均與對(duì)照組無顯著差異。但是，金征宇等［9］在飼料中分別添加60 mg/kg的加利紅素和蝦青素飼喂羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii，試驗(yàn)蝦的增重率分別較對(duì)照組提高4.04%和14.48%;Rehulka 等［6］在體質(zhì)量為 (178±23)g的虹鱒飼料中添加49.8 mg/kg的蝦青素，84 d后試驗(yàn)魚體質(zhì)量較對(duì)照組提高了5.4%;在日糧中添加50 mg/kg的蝦青素養(yǎng)殖獨(dú)角蝦、金魚，可提高其增重率［10］;用添加蝦青素的飼料飼喂凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei、日本沼蝦 Macrobrachium nipponense，試驗(yàn)蝦生長加快，促生長效果因劑量不 同 而 異［11］;Christiansen［12］、 Torrissen 等［13］、Chien等［14］也得出了類似結(jié)論。

綜合上述資料和本試驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為，類胡蘿卜素促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長很可能具有種類專一性。β－胡蘿卜素、蝦青素含量較高的蝦類以及體色較為鮮艷的魚類 (如金魚和虹鱒等)對(duì)這兩種色素的需要量較高，在飼料中適量添加后，促生長作用明顯;反之，β－胡蘿卜素、蝦青素含量不高的蝦類以及體色不鮮艷的魚類，對(duì)其需要量就不高，添加后促生長作用不明顯。

本試驗(yàn)中，仿刺參攝食添加90 mg/kg β－胡蘿卜素和60 mg/kg蝦青素的飼料時(shí)，生長速度較快，顯著高于對(duì)照組，表明仿刺參更接近β－胡蘿卜素、蝦青素含量較高的蝦類以及體色較為鮮艷的魚類，飼料中需要添加這兩種色素。

3.2 β－類胡蘿卜素和蝦青素對(duì)仿刺參抗氧化能力的影響

總抗氧化能力是指機(jī)體淬滅自由基和抗氧化能力的總和，是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)，包括酶促與非酶促兩個(gè)體系，酶促體系包括SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等，非酶促反應(yīng)體系包括維生素、類胡蘿卜素、氨基酸、金屬蛋白等。因此，抗氧化系統(tǒng)中幾種主要的抗氧化酶如SOD、CAT等常和總抗氧化能力一起作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)。

飼料中添加抗氧化劑是預(yù)防機(jī)體抗氧化損傷的有效方法之一［15］?？寡趸瘎┮话阃ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)增強(qiáng)其抗氧化能力。本試驗(yàn)中，攝食添加適量β－胡蘿卜素 (90 mg/kg)和蝦青素 (60 mg/kg)飼料的仿刺參體腔液中的總抗氧化能力均顯著高于對(duì)照組，而SOD、CAT活力卻顯著低于對(duì)照組。脂鯉Hyphessobrycon caltistus攝食添加蝦青素的飼料后血清中的總抗氧化能力升高［16］，但SOD和GPx活力降低;Pan等［17］發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon攝食添加蝦青素的飼料后血淋巴中T－AOC升高，SOD活力降低;中華絨螯蟹Eriocheir sinensis攝食添加適量β－胡蘿卜素飼料后體內(nèi)SOD活性降低［18］。這些都與本試驗(yàn)結(jié)果一致。其原因可能有兩點(diǎn):一是SOD能迅速、有效猝滅機(jī)體中的氧自由基，SOD被消耗;SOD與不同的金屬離子如Cu、Zn和Mn等結(jié)合，形成不同類型的復(fù)合物，催化超氧自由基歧化反應(yīng)，阻斷脂質(zhì)過氧化一級(jí)引發(fā)作用，分解機(jī)體產(chǎn)生的過氧化物，維持生物體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，SOD被大量消耗;CAT在將歧化作用產(chǎn)生的H2O2降解為H2O的過程中大量減少。所以，在添加了β－胡蘿卜素和蝦青素后抗氧化能力增強(qiáng)，SOD和CAT活力因消耗于增強(qiáng)免疫力而降低。二是添加β－胡蘿卜素和蝦青素后仿刺參總抗氧化能力增強(qiáng)，氧自由基等底物減少，也使SOD和CAT活力隨之降低。但是，仿刺參體腔液中總抗氧化能力增高而SOD和CAT活力下降究竟為何種原因尚需深入研究。

3.3 β－胡蘿卜素和蝦青素對(duì)仿刺參生長及抗氧化能力影響的比較

類胡蘿卜素作為著色劑、促長劑、抗氧化劑已被廣泛應(yīng)用于多種水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中。水產(chǎn)動(dòng)物自身不能合成類胡蘿卜素物質(zhì)，只能從食物中攝取。影響類胡蘿卜素在水產(chǎn)動(dòng)物中作用的因素主要有3個(gè)方面:水產(chǎn)動(dòng)物 (種類、規(guī)格和生理狀況等)、飼料 (營養(yǎng)、投喂方式，尤其是維生素A和維生素E水平等)和環(huán)境 (水質(zhì)等)。研究表明，類胡蘿卜素在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)促生長和抗氧化能力由強(qiáng)至弱依次為:蝦青素＞α－胡蘿卜素＞β－胡蘿卜素＞紅木素＞玉米黃質(zhì)＞黃體素＞膽紅素＞膽綠素。其中蝦青素的抗氧化能力最佳，比β－胡蘿卜素高10倍。

本試驗(yàn)中，相同添加量的各組平行比較表明，最低添加量 (30 mg/kg)的蝦青素、β－胡蘿卜素對(duì)仿刺參的促生長作用差異不顯著，但蝦青素在抗氧化方面的效果卻顯著高于β－胡蘿卜素，最低添加量 (30 mg/kg)時(shí)，蝦青素飼料組仿刺參體腔液的總抗氧化能力就顯著高于所有β－胡蘿卜素組。但當(dāng)蝦青素的添加量提高為60、90 mg/kg時(shí)，兩個(gè)蝦青素飼料組仿刺參體腔液的總抗氧化能力差異并不顯著。這可能是因?yàn)槲r青素的抗氧化性較強(qiáng)，僅需很少量便能顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物的總抗氧化能力，當(dāng)添加量進(jìn)一步提高后，蝦青素的總抗氧化能力逐漸趨于穩(wěn)定，而β－胡蘿卜素的含量較高時(shí)才能滿足水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化所需。

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