扁桃體和外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)CXCR5和IL-21水平對(duì)比分析

方會(huì)珍，曹莉萍

(1、江西省中醫(yī)藥研究院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330046；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

扁桃體是人體的次級(jí)淋巴組織。近年來(lái)，在次級(jí)淋巴組織的生發(fā)中心(Germinal center,GC)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群，被命名為濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular T helper cells,Tfh)，目前認(rèn)為是B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和發(fā)生類(lèi)別轉(zhuǎn)換，執(zhí)行有效的體液免疫應(yīng)答的主要輔助性T細(xì)胞亞群[1-2]。然而，在GC反應(yīng)中，T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用機(jī)制及過(guò)程迄今為止并未完全清晰，尤其是CD8+T細(xì)胞在其中是否發(fā)揮作用，目前文獻(xiàn)也鮮見(jiàn)報(bào)道。本文利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，分析比較了扁桃體和正常人外周血中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CXCR5和IL-21的水平，為進(jìn)一步探討外周淋巴組織中CD8+T細(xì)胞的異質(zhì)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 15例扁桃體組織來(lái)自因反復(fù)炎癥發(fā)作而行扁桃體切除(不分側(cè)別)的患者，其中男性10例，女性5例，年齡5～28歲，平均17.3歲。每位患者術(shù)前兩周內(nèi)均無(wú)急性發(fā)炎史，且未行任何抗菌素治療，術(shù)前血尿常規(guī)檢查均正常。12例外周血標(biāo)本來(lái)自健康體檢者，男性8例，女性7例，年齡10～42歲，平均22.8歲。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640 不完全培養(yǎng)液、牛血清白蛋白(BSA)、佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的鼠抗人CD8 單克隆抗體(FITC-CD8 mAb)、APC-CXCR5 mAb、PE-CD69 mAb 及其同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen 公司，PE-IL-21mAb 及其同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，流式細(xì)胞儀Calibur 購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.3 人扁桃體單個(gè)核細(xì)胞的制備 將手術(shù)摘除的新鮮扁桃體組織,用生理鹽水或Hank′s 液反復(fù)洗滌,剪去外周的結(jié)締組織,將扁桃體剪成小塊,用組織勻漿器將其碾磨制成細(xì)胞懸液,并用篩網(wǎng)過(guò)濾懸液，以淋巴細(xì)胞分離液分離出扁桃體中的單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和活力，備用。

1.4 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的制備 抽取健康體檢者外周血，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離人PBMCs,臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和活力，備用。

1.5 流式抗體染色細(xì)胞表面分子的染色：將細(xì)胞懸液調(diào)成1×106/ml的濃度，用PBS 洗滌細(xì)胞1～2次，100μl細(xì)胞懸液中加入一定量的抗體，4℃避光孵育30min，PBS 再洗滌細(xì)胞1～2次，倒去上清，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。IL-21的染色：1×106/ml的細(xì)胞懸液中加入激活劑PMA和Ionomycin，同時(shí)加入阻止細(xì)胞因子分泌至胞外的阻斷劑布雷菲德菌素A(BFA)，37℃孵育4min 后，收集細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞，4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10min，然后加入含1%皂甙的破膜劑于室溫避光處放置10min，PBS洗滌細(xì)胞，棄上清，最后加入熒光標(biāo)記的IL-21 抗體，4℃避光孵育30min 后，洗滌細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細(xì)胞比例的差異流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扁桃體組織中CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例僅為6.61%±1.91%，明顯低于正常人外周血中CD8+T細(xì)胞的比例(21.83%±4.56%)，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 扁桃體中CD8+T細(xì)胞比例低于PBMCs

2.2 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69的差異 檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面活化分子CD69 發(fā)現(xiàn)，與PBMCs 相比，扁桃體中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69的水平明顯升高，CD8+CD69+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的比例為42.83%±5.59%，而PBMCs 中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69的水平極低，CD8+CD69+T細(xì)胞比例為2.93%±1.61%(見(jiàn)圖2)。兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 扁桃體中CD8+T細(xì)胞高表達(dá)CD69

圖3 扁桃體和PBMC 中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CXCR5的差異

2.3 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細(xì)胞表達(dá)CXCR5的差異 FCM 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，扁桃體中CD8+CXCR5+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的比例為15.05%±5.13%，正常人外周血中CD8+CXCR5+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的比例為3.34%±1.63%(見(jiàn)圖3)，兩者相差非常顯著(P<0.05)。

2.4 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細(xì)胞表達(dá)IL-21的差異為了解CD8+T細(xì)胞是否能夠產(chǎn)生IL-21，我們用多克隆刺激劑PMA和Ionomycin 刺激扁桃體單個(gè)核細(xì)胞和PBMCs，4h 后用FCM 檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面IL-21的表達(dá)情況。如圖4顯示，扁桃體中CD8+T細(xì)胞能檢測(cè)到IL-21的表達(dá)(占總CD8+T細(xì)胞的4.64%±1.71%)，但是PBMCs 中CD8+T細(xì)胞基本不表達(dá)IL-21 (占總CD8+T細(xì)胞的0.34%±0.27%)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 扁桃體中CD8+T細(xì)胞能產(chǎn)生IL-21

3 討論

扁桃體作為人體免疫器官中的一個(gè)特化的二級(jí)淋巴器官，由于其解剖部位顯要，且生理功能尤其是免疫功能還不甚明了，因此多年來(lái)一直是人們研究的熱點(diǎn)[3-4]。已經(jīng)證實(shí)，扁桃體是一個(gè)富含B細(xì)胞的淋巴組織，目前普遍認(rèn)為扁桃體的功能以體液免疫為主，對(duì)其細(xì)胞免疫了解甚少。但是，最近在次級(jí)淋巴組織的淋巴濾泡確定了一個(gè)新的CD4+T細(xì)胞亞群，稱(chēng)之為T(mén)fh。研究發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞的一個(gè)重要表面標(biāo)志是表達(dá)趨化因子受體CXCR5，該受體通過(guò)與其相應(yīng)的配體CXCL13 作用，使Tfh細(xì)胞定位于次級(jí)淋巴組織的淋巴濾泡。此外，Tfh細(xì)胞的另一個(gè)重要特征是具有分泌IL-21的功能，在刺激B細(xì)胞的增殖、分化以及免疫球蛋白的類(lèi)別轉(zhuǎn)換中起著十分重要的作用[5]。那么，在扁桃體等次級(jí)免疫器官中，CD8+T細(xì)胞是否也表達(dá)CXCR5和IL-21 呢？

眾所周知，除CD4+T細(xì)胞外，CD8+T細(xì)胞也是免疫系統(tǒng)中參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一個(gè)重要功能性T細(xì)胞亞群，與CD4+T細(xì)胞不同的是，CD8+T細(xì)胞識(shí)別的是MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合的病毒或細(xì)菌抗原肽，主要在抗胞內(nèi)微生物感染中發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[6]。在次級(jí)淋巴組織，CD8+T細(xì)胞定位于T細(xì)胞區(qū)，被抗原遞呈細(xì)胞(如DC)提呈的抗原適當(dāng)刺激后，會(huì)迅速增殖并成為效應(yīng)細(xì)胞。當(dāng)被感染細(xì)胞逐漸被清除后，一部分抗原特異的CD8+T細(xì)胞被保留下來(lái)，成為長(zhǎng)壽命記憶細(xì)胞，在二次免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要作用。CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)主要通過(guò)靶向釋放溶細(xì)胞分子顆粒酶和穿孔素，以及表達(dá)死亡受體(Fas)等機(jī)制導(dǎo)致靶細(xì)胞損傷[7]。

本研究通過(guò)比較扁桃體和正常人外周血中的CD8+T細(xì)胞，證實(shí)扁桃體中CD8+T細(xì)胞的比例相對(duì)較少，且50%左右的CD8+T細(xì)胞組成性表達(dá)CD69，表明這些細(xì)胞可能處于早期分化和活化狀態(tài)[8]，這也可能與扁桃體中的免疫細(xì)胞經(jīng)常接觸外來(lái)抗原、不同程度地發(fā)生了活化有關(guān)。更有趣的是，扁桃體中也存在一部分CD8+CXCR5+T細(xì)胞。有觀點(diǎn)認(rèn)為，CD8+T細(xì)胞細(xì)胞表面不表達(dá)CXCR5[5]。盡管我們檢測(cè)到的這群CD8+CXCR5+細(xì)胞與CD8+CXCR5-細(xì)胞相比，表型和功能是否存在差異目前還不得而知，但扁桃體中CD8+CXCR5+T細(xì)胞的存在提示CXCR5 對(duì)于CD8+T細(xì)胞遷移到外周淋巴器官的作用同樣不可忽視。與扁桃體相比，我們?cè)谕庵苎幸矙z測(cè)了較低比例的CD8+CXCR5+細(xì)胞。我們推測(cè)這群細(xì)胞可能是從外周淋巴器官循環(huán)至外周血中，我們的結(jié)果與Quigley MF[9]等的結(jié)果基本一致。最后，我們也檢測(cè)了CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-21的能力，發(fā)現(xiàn)只有扁桃體中的CD8+T細(xì)胞能產(chǎn)生IL-21，而外周血中CD8+T細(xì)胞不產(chǎn)生IL-21。雖然扁桃體中CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-21的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CD4+T細(xì)胞，由于在外周淋巴組織，B細(xì)胞是IL-21 作用的主要靶細(xì)胞[10]，因此，CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-21 是否能夠?yàn)锽細(xì)胞提供輔助，還有待進(jìn)一步深入研究。

總之，我們采用FCM 檢測(cè)方法，初步探討了扁桃體中存在一群CD8+CXCR5+和CD8+IL-21+T細(xì)胞，為進(jìn)一步開(kāi)展這兩群細(xì)胞的功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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