和田苜蓿組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象研究

王庭輝，馬暉玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）屬豆科多年生植物，是世界上最重要的飼料作物，有“牧草之王”的美稱，目前世界苜蓿栽培面積為3500萬hm2，在我國已有2000年的栽培歷史［1］。自1958年Renert和Steward從胡蘿卜愈傷織和懸浮細(xì)胞體系中獲得體細(xì)胞胚以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，使得生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用成為了可能，大大加快了我國牧草育種的進(jìn)展［2］。王發(fā)生等［3］對紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生做了詳細(xì)研究。但是，在植物組織培養(yǎng)過程中超度含水態(tài)苗［4，5］，由于其難以移栽成活，嚴(yán)重影響植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。1981年Debergh等［6］提出了試管植物“玻璃化作用”的概念。陳兵先等［7］對植物組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象做了詳細(xì)報(bào)道。

通過組培體系獲得轉(zhuǎn)基因植株，是目前生物技術(shù)手段改良植物品種的途徑之一，而組培過程中出現(xiàn)的污染，褐化和玻璃化是影響植物組培體系建立的3大難題［8］，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，組培體系顯得尤為重要。陶銘［9］通過研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致再生苗玻璃化的原因主要有培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器、環(huán)境條件及外植體種類等，但其誘發(fā)機(jī)理至今尚無定論。李云霞等［10］以新疆大葉，甘農(nóng)三號和隴東苜蓿為試材，對紫花苜蓿組培體系中常見褐化原因進(jìn)行了分析并提出了解決辦法。吳麗芳等［11］對紫花苜蓿組織培養(yǎng)中常見問題也提出了解決對策。同時(shí)，亓建飛等［12］對組培中畸形苗的發(fā)生機(jī)理做了闡述。擬通過摸清影響和田苜蓿組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的部分因素，提出應(yīng)對措施，為消除紫花苜蓿組織培養(yǎng)過程中的玻璃化現(xiàn)象提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

成熟的和田苜蓿種子采自新疆和田地區(qū)民豐縣苜蓿原種站。

1.2 方法

挑選飽滿顏色較好的新疆和田苜蓿種子，用自來水浸泡40min，用75%酒精處理30s，后用0.1%升汞浸泡10min，無菌水沖洗4～5次，將種子表面的升汞沖洗干凈，接于MS培養(yǎng)基中，室內(nèi)自然光光照培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至2～3cm，取其下胚軸為外植體，切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉(zhuǎn)接于 MS＋2.0mg/L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂［11］誘導(dǎo)愈傷組織，時(shí)間為20～25d（圖1－1）。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到前期分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基為 MS＋6－BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋瓊脂0.9%［13］（圖1－2），直至分化出幼小再生苗。

30～35 d后選取健康無污染的幼小和田苜蓿再生苗接種在MS基本培養(yǎng)基上，設(shè)置不同濃度6－BA和NAA的組合、不同蔗糖含量、不同瓊脂濃度、不同光照強(qiáng)度作單因子處理，每個(gè)處理20株，每瓶5株，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：25～28℃，光照周期16h。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

在不同因素作用下，培養(yǎng)30d后，觀察并統(tǒng)計(jì)組培苗出現(xiàn)玻璃化的情況，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素的差異顯著性分析，并按公式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 6－BA和NAA濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加20g/L蔗糖，7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度6－BA和NAA，在光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養(yǎng)后的和田苜蓿再生苗，接種30d后觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著6－BA和NAA濃度的升高，再生苗玻璃化率逐漸增大，當(dāng)6－BA為2.0mg/L、NAA 為0.5mg/L時(shí)其增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1.93，玻璃化率為38%；當(dāng)6－BA為2.0mg/L、NAA 為1mg/L 時(shí)，其增殖系數(shù)為1.75，玻璃化率為60%（圖1－3），研究表明，隨著6－BA和NAA濃度的升高，和田苜蓿再生苗的玻璃化現(xiàn)象加重，而其再生苗增殖系數(shù)先升高后降低。綜合考慮，選擇2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA為和田苜蓿再生苗分化的最佳激素濃度配比。

2.2 蔗糖濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

將繼代培養(yǎng)的分化苗接種于添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA和7g/L的瓊脂的MS培養(yǎng)基中并附加不同濃度的蔗糖，在光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2），隨著蔗糖濃度的增加，再生苗的玻璃化率逐漸降低，當(dāng)蔗糖濃度為30g/L時(shí)，其玻璃化率最低，為17%；增殖系數(shù)在增大的情況下又減小，當(dāng)蔗糖濃度為20g/L的時(shí)候，其增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1.63。當(dāng)蔗糖濃度為20g/L和25g/L時(shí)，其增殖芽數(shù)最多，增殖系數(shù)差異不顯著，并且玻璃化率比較低（圖1－4），所以當(dāng)蔗糖濃度為20～25g/L時(shí)適合和田苜蓿再生苗的生長。

表1 不同激素濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 1 Effect of different hormones combination on vitrification of hetian alfalfa

表2 不同蔗糖濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 2 Effect of sugar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.3 瓊脂濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 和20 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中加不同濃度的瓊脂，光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養(yǎng)后的再生苗，30d后觀察。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著瓊脂濃度的增大，其玻璃化率逐漸減小，當(dāng)瓊脂濃度為5g/L時(shí)，再生苗玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重（表3，圖1－5），玻璃化率達(dá)到78%。瓊脂濃度為7g/L和8g/L時(shí)，其增殖系數(shù)差異性顯著，玻璃化率差異性不顯著，因此，選擇7g/L的瓊脂濃度作為和田苜蓿最佳的再生苗分化濃度。

表3 不同瓊脂濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 3 Effect of agar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.4 光照強(qiáng)度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在含2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA＋20g/L蔗糖＋7g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，接種繼代培養(yǎng)后的和田苜蓿再生苗，置于不同光照強(qiáng)度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，30d后觀察。結(jié)果表明，隨著光照強(qiáng)度增加，再生苗芽增殖能力先升高再下降，在光照強(qiáng)度為1 000lx時(shí)，增殖芽數(shù)最多，為25.67，其增殖系數(shù)最大；當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000lx和1 200lx時(shí)，其增殖系數(shù)差異性不顯著。當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000lx和1 200lx時(shí)，和田苜蓿玻璃化苗情況不嚴(yán)重，玻璃化率明顯低于其他2個(gè)光照強(qiáng)度（表4，圖1－6）。因此，選擇1 000～1 200lx的光照強(qiáng)度為和田苜蓿再生苗分化培養(yǎng)的光照強(qiáng)度。

表4 不同光照強(qiáng)度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 4 Effect of Light intensity on vitrification of hetian alfalfa

圖1 和田苜蓿再生狀況Fig.1 Regeneration of hetian alfalfa

3 討論

玻璃化苗現(xiàn)象普遍存在于組織培養(yǎng)過程中，試管苗玻璃化嚴(yán)重影響了植物組織培養(yǎng)的效率和質(zhì)量，因此，試管苗玻璃化問題的解決有助于整個(gè)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展和其遺傳體系的建立［14］。而且，在試管苗增殖過程中，一旦形成玻璃化苗，其增殖系數(shù)會(huì)明顯下降，不利于繼代和生根培養(yǎng)，降低了組培的效率［15］。在植物組織培養(yǎng)中，蔗糖一直被作為標(biāo)準(zhǔn)碳源，蔗糖的用量是組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一。成細(xì)華等［16］在結(jié)球白菜組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的蔗糖不僅不能克服玻璃化現(xiàn)象，而且抑制了不定芽的分化。因此，適當(dāng)提高蔗糖濃度對培養(yǎng)壯苗很有必要［17］，何芳蘭等［18］認(rèn)為，增加蔗糖和瓊脂的濃度，可以在不同程度上減少高山杜鵑試管苗玻璃化的發(fā)生，當(dāng)瓊脂濃度0.6%時(shí)，其玻璃化率低，增殖系數(shù)高。研究通過蔗糖和瓊脂的不同濃度發(fā)現(xiàn)，在和田苜蓿的組織培養(yǎng)中，利用MS培養(yǎng)基，增加適宜濃度的瓊脂，可以降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢，造成細(xì)胞吸水阻遏，從而降低玻璃化。適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量，也可降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分，降低玻璃化現(xiàn)象。

研究報(bào)道，玻璃化苗發(fā)生百分率和細(xì)胞分裂素成正相關(guān)，其中，6－BA的影響大于ZT和KT［19］。適當(dāng)?shù)募に亟M合可以降低試管苗的玻璃化。實(shí)驗(yàn)研究中，在MS＋2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 的培養(yǎng)條件下，和田苜蓿玻璃化程度降低，所以，和田苜蓿組織培養(yǎng)可通過調(diào)整6－BA（2.0mg/L）和 NAA（0.5mg/L）的作用濃度，降低和田苜蓿的玻璃化現(xiàn)象，并且其再生芽增殖較明顯。研究建議今后這些措施可以應(yīng)用于苜蓿組織培養(yǎng)過程中，消除玻璃化現(xiàn)象，提高苜蓿組織培養(yǎng)的效率。

在植物組織培養(yǎng)中，光照是影響培養(yǎng)效果的主要因子之一［20］。桂明春等［22］通過對橡膠樹不定芽誘導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度能顯著影響不定芽的生長和形態(tài)，不同光照強(qiáng)度下誘導(dǎo)出的不定芽嫩綠程度不同。研究發(fā)現(xiàn)，在和田苜蓿誘導(dǎo)分化階段，光照強(qiáng)度對不定芽的再生和植物葉片的形態(tài)具有顯著影響，當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx時(shí)，其不定芽嫩綠，玻璃化情況不嚴(yán)重。因此，不同的植物，選擇適宜的光照強(qiáng)度對組織培養(yǎng)體系的建立具有重要作用。

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