志賀菌感染的多重PCR快速診斷技術(shù)的建立

王國富 吳利先 薛士鵬

志賀菌(shigellosis)又稱痢疾桿菌，能侵襲結(jié)腸粘膜上皮細胞，引起人類細菌性痢疾。傳統(tǒng)的檢測方法必須經(jīng)過分離培養(yǎng)和生理生化鑒定，甚至于全自動細菌鑒定儀等，檢測周期長、步驟繁瑣、許多因素難以控制，甚至存在誤診和漏診，已經(jīng)顯現(xiàn)出很大的局限性。因此急需建立快速、敏感、特異的檢測方法診斷菌痢，以采取有效防治措施。

隨著微生物基因組學的發(fā)展，對志賀菌的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚，分子生物學檢測技術(shù)應用于志賀菌快速診斷已經(jīng)成為可能，本研究在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上引入了多重PCR技術(shù)，將為臨床快速診斷志賀菌提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 68株志賀菌來源于2010～2011年大理地區(qū)腹瀉患者的糞便標本，大腸埃希菌和傷寒沙門菌由本室保存，PCR擴增儀為PE公司產(chǎn)品，PCR試劑盒購自北京晨綠生物公司。PCR所用引物:參照文獻針對4個毒力基因設計4對引物，由北京晨綠生物公司合成如下:

表1 志賀菌多重PCR診斷所用需的4個毒力基因的4對引物

1.2方法

1.2.1用鑒定過的志賀菌進行多重PCR 將鑒定過的志賀菌培養(yǎng)過夜，分別取100 μl培養(yǎng)過夜菌，離心棄上清后加50 μl去離子水，沸水煮10 min后離心，取菌裂解液的上清2 μl為PCR模板，濃度為25 μmol/L的P1～P8各1 μl為引物進行PCR。反應條件為:95℃4 min后，按下列參數(shù)循環(huán)35次，94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，最后72℃延伸8 min。同時設大腸埃希菌為陰性對照。凡除了423bp處(ipaH)出現(xiàn)條帶外，其他309bp(shetlA)、147bp(shetlB)及320bp(ial)任意一處出現(xiàn)條帶均為陽性。凝膠成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.2.2直接用陽性糞便標本進行的多重PCR 為了確定多重PCR在志賀菌快速診斷中應用，本研究選取5份志賀菌陽性的粘液膿血便標本，直接用多重PCR進行擴增。具體方法是:取糞便標本0.2 g，用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA，然后取2 μl作為模板，按上述參數(shù)進行擴增。

2 結(jié)果

2.1用鑒定過的志賀菌進行多重PCR結(jié)果 通過多重PCR擴增后，大腸埃希菌和傷寒沙門菌未出現(xiàn)條帶，68株志賀菌均在423bp處出現(xiàn)了條帶，其余的在147bp處、309bp處以及320bp處均出現(xiàn)了至少一個條帶，與常規(guī)鑒定法的符合率達100%，結(jié)果見圖1。

圖1 多重PCR檢測分離鑒定后的志賀菌毒力基因

2.2直接用陽性糞便標本進行多重PCR結(jié)果5份直接用糞便標本提取的DNA為模板進行多重PCR擴增后，也得到了同樣的結(jié)果，見圖2。

圖2 多重PCR直接檢測糞便中的志賀菌毒力基因

3 討論

志賀菌所致的細菌性痢疾已經(jīng)成為嬰幼兒腹瀉的第三大病因。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)存在很大局限性。多聚酶鏈反應(PCR)具有快速、特異性和敏感性，已被國外學者用于追蹤和檢測細菌性腹瀉［3，4］，特別是對菌量較少標本或經(jīng)藥物治療標本中活菌量不多的標本，還有血清學標記不能鑒定的腹瀉菌種。多重PCR是在同一個反應管中用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同，但更能全方位高效率地檢測志賀菌［1］。

Buysse等發(fā)現(xiàn)志賀菌侵襲性質(zhì)?？乖璈(invasive plasmid，ipaH)存在于各型志賀菌，同時多拷貝存在于染色體和上，不隨傳代而丟失。但據(jù) Phantouamath等［2］研究結(jié)果表明，單用ipaH基因PCR結(jié)果陽性并不一定發(fā)病，多是痢疾桿菌攜帶者。侵襲相關(guān)基因ial存在于侵襲性大質(zhì)粒上一個2.5kb侵襲相關(guān)區(qū)段中，是志賀菌的又一毒力基因。后來Fasano等又報道兩種志賀菌腸毒素編碼基因shet1A和shet1B。菌痢患者除了ipaH基因陽性外，ial或shet1A或shet1B基因檢測同時陽性，才能證明是痢疾桿菌感染，且具有致病性。因此本研究根據(jù)志賀氏菌的這4個特異性基因片段中的開放框架部分序列設計引物，進行多重PCR檢測。

本研究選擇了本室通過常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定得到的68株志賀菌進行多重PCR擴增。結(jié)果68例志賀菌ipaH基因均為陽性;ial基因陽性率達95.6%(65/68)，shet1B基因為陽性率達89.7%(61/68)，shet1A基因陽性率為55.9%(38/68)。而傷寒沙門菌和大腸埃希菌的結(jié)果陰性，表明PCR法有很高的特異性。直接用糞便標本通過層析柱提取DNA后擴增結(jié)果同樣為陽性。雖然糞標本中存在著己知和未知的抑制或干擾PCR檢測的成分，但本試驗模板DNA的提取使用的是QIAamp層析法，直接從糞中提取DNA。QIAamp是一種硅膠，能選擇性結(jié)合DNA而分離糖類和蛋白質(zhì)。將經(jīng)過離心、溶菌酶和蛋白酶K處理的糞標本，用乙醇沉淀后，過QIAamp柱，再經(jīng)Centrisep柱處理，可消除PCR抑制物，使檢測的靈敏度達特異性都大大提高［5］。因此多重PCR技術(shù)檢測志賀菌，具有快速、敏感和特異等優(yōu)點，盡管不能區(qū)分菌種，但在臨床診斷、治療監(jiān)測及流行病學調(diào)查方面顯示出良好的實用性。

［1］Kotloff K L，Winickoff J P，Ivanoff B，et al.Global burden of Shigella infections:implications for vaccine development and implementation of control strategies.Bull World Health Organ，1999，77:651-6661.

［2］Phantouamath B，Sithivong N，Insisiengmay S，et al.Pathogerticity of Shigella in healthy carriers:a study in Vientiane，Lao People?s Democratic Republic .Jpn J Infect Dis，2005，58(4):232-234.

［3］Thong KL，Hoe1 SLL，Puthucheary SD，et al.Detection of virulence genes in Malaysian Shigella species by multiplex PCR assay.BMC Infect Dis，2005，5:8.

［4］陳晶，楊春莉，裘宇蓉，等.武漢社區(qū)腹瀉病人糞便中致病菌的構(gòu)成與耐藥性研究.熱帶醫(yī)學雜志，2007，7(4):326-329.

［5］李小麗，陰赦宏，溫艷，等.PCR快速檢測腹瀉患者糞中痢疾桿菌致病基因.世界華人消化雜志，2007，15(19):212-213.