SPIO標記兔BMSCs的生物學特性與體外MRI顯像研究*

1. 中山大學附屬第一醫(yī)院放射科（廣東 中山 510080）

2. 中山大學附屬第一醫(yī)院骨科

3. 中山大學附屬第一醫(yī)院病理科

4. 中山大學醫(yī)學院生理學教研室

高振華1 胡曉書1 蔡華松1尹軍強2 劉大偉3 崔 宇4

SPIO標記兔BMSCs的生物學特性與體外MRI顯像研究*

1. 中山大學附屬第一醫(yī)院放射科（廣東 中山 510080）

2. 中山大學附屬第一醫(yī)院骨科

3. 中山大學附屬第一醫(yī)院病理科

4. 中山大學醫(yī)學院生理學教研室

高振華1胡曉書1蔡華松1尹軍強2劉大偉3崔 宇4

目的 采用超順磁性氧化鐵（SPIO）作為磁探針標記兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）, 探討不同濃度SPIO的磁標記效率及其對細胞活力的影響，觀察標記干細胞體外MR顯像情況。 方法 采用含鐵不同濃度（11.2μg/ml、22.4μg/ml、44.8μg/ml）的SPIO標記兔BMSCs，分別行普魯士藍染色和MTT比色法檢測其標記效率和BMSCs增殖活性，同時觀察不同濃度磁標記細胞組（1×106、1×105、1×104和1×103細胞數(shù)/ml）和對照組（1×106細胞數(shù)/ml）的T1WI、T2WI及T2*WI體外顯像信號。結果SPIO標記BMSCs中鐵含量越高，其標記率越高，含鐵濃度為22.4μg/ml時磁標記率達95%且對BMSCs生長活性無明顯影響。三種MR序列信號變化隨細胞濃度的增加，其信號變化越明顯，但在相同細胞濃度下，T2

*WI信號變化率最大（P<0.05）。 結論采用含鐵濃度為22.4μg/ml的SPIO來標記BMSCs，其磁標記率和安全性均很高。T2

*WI是體外示蹤磁標記BMSCs最佳的MR成像序列。

超順磁性氧化鐵；骨髓干細胞；磁共振成像

骨髓間充質干細胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）移植是目前骨組織工程研究的熱點內容之一，國內外許多學者采用BMSCs進行股骨頭壞死缺損修復的實驗研究[1-3]。而利用MRI活體實時動態(tài)觀察磁標記BMSCs在植入體內的分布及存活狀況，對于在體評估干細胞移植的效果具有重要意義[4、5]。本研究通過觀察超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO )標記對兔BMSCs生物學特性的影響以及標記干細胞體外MR顯像研究，為 MRI活體示蹤BMSCs在兔股骨頭壞死的療效評估奠定基礎。

資料與方法

1.1 實驗動物實驗用健康雄性新西蘭大白兔6只，1.5月齡，體重540g，由中大實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器設備DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS），胰蛋白酶，鼠抗兔CD29、CD34單克隆抗體，四甲基偶氮唑藍（MTT），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），超順磁性氧化鐵（SPIO，商品名Feridex，購自Advanced公司），PBS（磷酸鹽緩沖溶液）。倒置相差顯微鏡（Nikon），熒光倒置顯微鏡（Zeiss），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司,美國），超凈工作臺（國產），臺式高速離心機（HETTIH公司,德國），全自動酶標儀（Thermo），3.0T MR成像儀（Siemens，德國）,24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板,25cm2培養(yǎng)瓶(CORNING,美國）。

1.3 主要實驗方法和觀察指標采用密度梯度離心法體外分離培養(yǎng)兔骨髓的BMSCs，對其進行免疫細胞化學熒光CD29、CD34染色和DAPI染色雙重鑒定；采用含鐵不同濃度（11.2μg/ml、22.4μg/ml、44.8μg/ml）的SPIO- FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs 48h，細胞密度為1×105細胞數(shù)/ml；再行普魯士藍染色檢測其標記效率，其判斷方法是顯微鏡不同視野下計數(shù)500個細胞，統(tǒng)計細胞內鐵染色陽性細胞數(shù)；采用四唑鹽（MTT）比色法檢測SPIO對所標記BMSCs增殖活性的影響，對照組采用不含SPIO的培養(yǎng)基培養(yǎng)。將SPIO標記的不同濃度（1×106、1× 105、1×104、1×103細胞數(shù)/ml）細胞懸浮于DMEM/F12完全培養(yǎng)液中置于15ml離心管中，1×106/ml未標記細胞及DMEM/F12完全培養(yǎng)液作為對照組，采用德國Siemens公司3.0T超導型磁共振儀體外成像。采用頭線圈，軸位掃描，層厚2mm，成像序列包括SE T1WI（TR 320ms，TE 10ms）、TSE T2WI（TR 3200ms，TE 120ms）和GRE T2*WI（TR 320ms，TE 16ms，翻轉角15°）。觀察比較體外3種不同MRI成像序列上標記細胞與未標記細胞的信號強度隨不同細胞濃度的變化，并計算信號強度變化率Δ SI=[（|SIL-SIU|）/SIU]×100%（其中SIL及SIU分別為標記及未標記BMSCs的MR信號強度）。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對不同濃度磁標記干細胞的增殖活性和三種MR成像序列間信號變化率分別進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的原代細胞呈圓形，培養(yǎng)36h后換液，除去未貼壁細胞和殘渣等成分，可見貼壁細胞呈多角形或梭形。3d后細胞集落較明顯形成以梭形細胞為主（圖1）。6d時細胞近完全融合狀態(tài)。傳代后的細胞形態(tài)類似與原代培養(yǎng)的細胞，但細胞貼壁及增殖速度較原代細胞明顯增快。

2.2 BMSCs的鑒定免疫細胞化學熒光染色中，約96%細胞CD29表達陽性，表現(xiàn)為胞漿中見大量強度較高的綠色熒光信號（圖2），CD34表達陰性，表現(xiàn)為胞漿中極低的熒光信號強度。DAPI染色中，細胞核為藍色的是骨髓基質干細胞的細胞核（圖3）。

2.3 BMSCs的SPIO標記效率采用11.2μg/ml、22.4μg/ml和44.8μg/ml三種不同含鐵濃度的SPIO標記BMSCs 48h后行普魯士藍染色，光鏡下觀察標記細胞質內可見藍染鐵顆粒而未標記細胞內未見藍染顆粒。本組結果中SPIO標記 BMSCs的含鐵濃度越高，標記率越高；當含鐵濃度為22.4μg/ml時，細胞內藍染顆粒標記率達95%（圖4）；含鐵濃度為44.8μg/ml時，細胞內藍染顆粒聚集成堆，鐵染色陽性率近100%。

圖1 兔BMSCs原代培養(yǎng)3d后鏡下觀（×100），細胞呈多角形或梭形，以梭形細胞為主；圖2 兔BMSCs免疫熒光CD29染色（×400）胞漿中見大量強度較高的綠色熒光信號；圖3 兔BMSCs DAPI 染色（×200）胞核呈深藍染色；圖4 含鐵濃度22.4μg/ml的SPIO標記BMSCs后普魯士藍染色（×200），細胞內藍染顆粒陽性率達95%。

2.4 SPIO標記BMSCs的增殖活性采用細胞濃度為1×105細胞數(shù)/ml對不同含鐵濃度（22.4μg/ml和44.8μg/ml）的SPIO-PBS培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs 48h后MTT比色法檢測，結果顯示兩種含鐵濃度SPIO標記的細胞與未標記細胞的臺盼藍拒染率相近，分別為95%、92%和100%，其差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 SPIO標記BMSCs的體外MR顯像分別對SPIO（含鐵濃度為22.4μg/ml）標記的不同細胞濃度（1×106、1×105、1×104、1×103細胞數(shù)/ml）的標記細胞及未標記（1×106細胞數(shù)/ml）的細胞對照組行T1WI、T2WI、I序列3.0T MR掃描。相對于未標記的對照組信號，T1WI序列見標記細胞信號升高，T2WI及I序列均見標記細胞信號降低，三種序列信號變化隨細胞濃度的增加，其信號變化越明顯（圖5）。在相同細胞濃度下，I信號變化率最大，T1WI信號變化最小，三種序列間信號變化率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖5 不同細胞濃度（106、105、104、103細胞數(shù)/ml）SPIO標記BMSCs與未標記對照組（106細胞數(shù)/ml）的T1WI、T2WI和T2*WI顯像比較。

討 論

骨髓由造血和基質系統(tǒng)組成，骨髓基質為造血系統(tǒng)提供結構和功能支持，其成骨潛能來源于基質系統(tǒng)的BMSCs。骨髓組織來源的骨髓基質干細胞因較易獲取，培養(yǎng)擴增簡便、較強的成骨潛能保持對骨壞死修復能力，而傳代能力強，每傳一代，細胞數(shù)量就增加2-4倍，是目前最理想的骨組織工程種子細胞[6]。

目前，實驗室常用分離純化BMSCs的方法有全骨髓貼壁培養(yǎng)法[7]和密度梯度離心法[8]，本研究采用骨髓沖洗法從幼年新西蘭大白兔股骨干骨髓組織獲得待培養(yǎng)組織，采用密度梯度離心法分離骨髓基質干細胞在體外進行貼壁培養(yǎng)，成功獲得活性及傳代能力很強的純化兔BMSCs。而BMSCs的鑒定主要借助其表面抗原性，BMSCs在細胞貼壁附著后表達CD29、CD44等多種表面蛋白，但不表達造血干細胞表面標志CD14和CD34等[9]。本實驗除利用免疫細胞化學對細胞漿CD29和CD34熒光染色外，同時結合DAPI細胞核染色來準確鑒定出所培養(yǎng)的細胞為兔BMSCs而非造血干細胞。

SPIO因其直徑一般在納米數(shù)量級，且具有強大的順磁效應，因此可將其作為磁標記探針來標記細胞進行MRI成像。SPIO被證實能夠在細胞內較長時間持續(xù)存，經活體成像后能夠準確地反映所標記細胞的行為，包括細胞所在的位置、數(shù)量及遷徙。SPIO標記BMSCs后，從光學顯微鏡下可觀察到鐵粒子被吞噬在 BMSCs 的細胞漿中。細胞標記效率與標記細胞種類、使用SPIO與轉染劑的種類及濃度、共培養(yǎng)時間等有關[10]，而且每種細胞及對應的標記策略的安全性檢測至關重要。本實驗對含不同F(xiàn)e3＋濃度的SPIO對BMSCs的標記率及其安全性進行觀察，結果顯示在一定范圍內SPIO的含鐵濃度越高，測得的BMSCs鐵含量越高，標記率也越高，含鐵濃度在22.4μg/ml時的標記率已達95%，而且SPIO對BMSCs生長活性無明顯影響。

相對于檢測干細胞的敏感性而言，MRI低于光學成像及核素顯像方法，但MRI具有良好的空間分辨率、軟組織分辨率及時間分辨率，無電離輻射，移植干細胞經過磁性物質標記后,可很好的顯示移植細胞，而且可以在示蹤干細胞的同時監(jiān)測干細胞移植的治療效果，在干細胞治療領域得到廣泛應用[11,12]。超順磁性氧化鐵顆粒標記細胞后以囊泡的形式存在于細胞質中，囊泡在細胞中及細胞在組織中呈不均勻分布，造成局部磁場的不均勻，從而加速了質子去相位，明顯縮短T2及弛豫時間，使組織信號降低，而對T1弛豫影響較小[13]。本研究采用SPIO標記BMSCs的體外3.0T MR成像觀察，證實了SPIO主要縮短及T2弛豫時間，I序列檢測SPIO標記細胞最敏感[12-14]，且1×103細胞數(shù)/ml的細胞濃度即可引起明顯信號變化，提示隨著MR儀器磁場強度的增加，對磁標記干細胞的顯示更敏感。

總之，本實驗采用含鐵濃度為22.4μg/ml的SPIO來標記BMSCs，其磁標記率和安全性均很高；T2

*WI是磁標記BMSCs體外MR成像的最佳掃描序列。

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Biological Characteristics and MR Imaging in Vitro of SPIO Labeled Rabbit BMSCs*

GAO Zhen-hua, HU Xiao-shu, CAI Hua-song, et al. Department of Radiology, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Zhongshan Guangzhou 510080, China

ObjectiveTo label rabbit bone marrow stem cells (BMSCs) with superparmagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) as a magnetic probe and to explore the effects of magnetic cell labeling with various concentrations of SPIO on cellular biological characteristics, and MR signals in vitro.MethodsBMSCs were labeled by SPIOs with different concentrations of 11.2μg/ml, 22.4μg/ml and 44.8μg/ml, respectively. Intracellular irons was evaluated with Prussian blue stain, and cell proliferation was evaluated by using MTT assay. Different concentrations of labeled BMSCs suspended in medium and the control cells were scanned using T1WI，T2WI and T2*WI sequences, and then percentage change in signal intensity normalized to the unlabeled cells was investigated.ResultsThe more irons in SPIO labeled BMSCs, the higher was cellular labeling efficiency. For SPIO labeling with concentrations of 22.4μg/ml, the labeling efficiency was approximately 95% and the viability and proliferation of the labeled cells were unaffected by compared with these characteristics of unlabeled cells. The change in MR signal intensity increased at T1WI, T2WI and T2*WI along with elevation of the labeled cells concentration,and There were more significant in the change of signal intensity at T2*WI than T1WI and T2WI under the same cell concentration (P<0.05).ConclusionBMSCs was labeled by SPIO of 22.4μg/ml has higher cellular labeling efficiency and cell proliferation. Compared with T1WI and T2WI, T2*WI is the most sensitive sequence for MR tracking of SPIO labeled BMSCs in vitro.

superparamagnetic iron oxide; bone marrow stromal cells; magnetic resonance imaging

R445.2

A

廣東省醫(yī)學科研基金項目（編號：B2010073）

10.3969/j.issn.1672-5131.2012.05.001

高振華

book=4,ebook=227

（本文編輯：任曉璇）

2012-03-18