響應(yīng)面法優(yōu)化制備南瓜籽抗氧化肽的工藝

范三紅，毛強(qiáng)強(qiáng)，王亞云，馮雨薇，劉艷榮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

響應(yīng)面法優(yōu)化制備南瓜籽抗氧化肽的工藝

范三紅，毛強(qiáng)強(qiáng)，王亞云，馮雨薇，劉艷榮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

以南瓜籽分離蛋白為原料，采用酸性蛋白酶酶解制備南瓜籽抗氧化肽。選用加酶量、酶解溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間作為研究對象，以酶解液對DPPH自由基的清除率為評價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Plackett-Burman篩選試驗(yàn)確定顯著因素，然后通過三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備南瓜籽抗氧化肽的酶解工藝條件。結(jié)果表明：酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：酶解溫度50℃、pH2.5、酶解時(shí)間5h、底物質(zhì)量濃度0.05g/mL、加酶量6000U/g pro，在此條件下，DPPH自由基清除率可達(dá)到92.82%。

響應(yīng)面法；南瓜籽；抗氧化肽；酶解工藝；優(yōu)化

隨著人們生活水平的提高，活性氧和自由基導(dǎo)致的各種疾病嚴(yán)重危害了人類的健康，已經(jīng)引起了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。近年來，評價(jià)和篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢，而各種原料產(chǎn)生的抗氧化肽由于其低毒、高效等特點(diǎn)，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

目前，從廉價(jià)易得的動(dòng)植物原料制備抗氧化肽的研究有很多，這些原料主要有大豆蛋白[1]、玉米蛋白[2]、麥胚蛋白[3]、乳蛋白[4]、魚類蛋白[5]等，此外在牛奶蛋白、家蠅幼蟲蛋白等動(dòng)物蛋白原料，以及黑米、菜籽、靈芝、枸杞等植物蛋白原料中均獲得了具有抗氧化作用的活性肽[6]。由此可見，生產(chǎn)抗氧化肽的原料范圍非常廣泛。

南瓜籽作為南瓜的副產(chǎn)品，來源廣泛，產(chǎn)量巨大，其榨油后的餅粕含有豐富的蛋白質(zhì)[7]，直接廢棄造成資源的極大浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)即利用酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白制備抗氧化肽，同時(shí)應(yīng)用響應(yīng)面法[8-10]優(yōu)化酶解工藝，為南瓜籽蛋白的充分利用和南瓜籽肽類產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜籽分離蛋白(總蛋白含量91.07%) 實(shí)驗(yàn)室自制；酸性蛋白酶(固態(tài)，酶活力為10萬U/g pro以上) 寧夏和氏璧公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2800AH型紫外-可見分光光度計(jì) 龍尼柯(上海)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TG16A-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)有限公司；868型pH測試儀 美國奧立龍公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定[11]

DPPH自由基清除率采用比色法，具體過程為：在反應(yīng)管中加入2mL 0.2mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，再加入2mL 南瓜籽蛋白水解液，混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)50min 后，于517nm 波長處測定吸光度。同時(shí)以2mL DPPH溶液與2mL 蒸餾水混合后的吸光度為對照組；以2mL 蒸餾水與2mL 乙醇混合后的吸光度為空白組。

式中：A1為加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為未加水解液時(shí)DPPH溶液的吸光度。

1.3.2 南瓜籽蛋白酶解液的制備

配制一定質(zhì)量濃度的南瓜籽分離蛋白溶液，在沸水中加熱處理10min，冷卻至酶解反應(yīng)的最適溫度，調(diào)節(jié)一定的pH值，然后按一定比例加入蛋白酶，反應(yīng)過程中使pH值保持恒定。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間，沸水浴滅酶10min，冷卻后5000r/min離心20min，上清液置于冰箱中待用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 酶添加量的確定

配制底物質(zhì)量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調(diào)pH值為3.5，在溫度為50℃，加酶量分別為500、2000、4000、6000、8000U/g pro的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定較適的加酶量。

1.3.3.2 酶解溫度的確定

配制底物質(zhì)量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調(diào)pH值為3.5，在加酶量為6000U/g pro，溫度分別為30、40、45、50、55℃的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定酶解的較適溫度。

1.3.3.3 pH值的確定

配制底物質(zhì)量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，在加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃，pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定酶解的較適pH值。

1.3.3.4 底物質(zhì)量濃度的確定

分別配制底物質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、 0.10g/mL的南瓜籽蛋白溶液，在pH值為2.5、加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃條件下酶解4h。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定酶解的較適底物質(zhì)量濃度。

1.3.3.5 酶解時(shí)間的確定

配制底物質(zhì)量濃度為0.05g/mL的南瓜籽蛋白溶液5份，調(diào)pH值為2.5，在加酶量為6000U/g pro、溫度為50℃的條件下分別酶解2、4、6、8、10h，測定酶解液的DPPH自由基清除率，確定較適的酶解時(shí)間。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了N＝12 的Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值Y，篩選出影響最顯著的3個(gè)因素即：加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間，然后結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[16]，開展三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)共有15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為分析因子，3個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行3次，以估計(jì)誤差。試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，重復(fù)3次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件MINITAB15.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 加酶量對抗氧化活性的影響

圖1 加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖1可知，南瓜籽蛋白酶解液對DPPH自由基的清除率隨著酶用量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)加酶量超過 6000U/g pro時(shí)，這種趨勢變得緩慢。這可能是由于加酶量小于6000U/g pro時(shí)，在底物質(zhì)量濃度一定的情況下，增加的酶量未使底物質(zhì)量濃度飽和，隨著加酶量的增大，反應(yīng)速度越快，蛋白質(zhì)水解度也越高，得到的多肽液清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。而當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，底物質(zhì)量濃度相對較低，酶分子過飽和，所以水解程度變化不大，活性多肽的量不再增加。同時(shí)，酶量的增加也會(huì)使生產(chǎn)成本大大增加，所以選擇酶用量為6000U/g pro較為合適。

2.1.2 溫度對抗氧化活性的影響

圖2 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

溫度對酶催化反應(yīng)的影響是多方面的，溫度提高會(huì)影響酶的穩(wěn)定性和底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度[12]。由圖2可知，50℃左右時(shí)南瓜籽蛋白酶解液表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，酶促反應(yīng)的速度加快，水解度增大，活性多肽的含量增加；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活降低，使活性肽的含量保持在一定水平。因此較適宜的酶解溫度為50℃。

2.1.3 pH值對抗氧化活性的影響

圖3 pH值對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

pH值能影響酶活性部位的解離和底物蛋白的解離，從而直接影響了酶與底物蛋白的結(jié)合與催化,每個(gè)催化反應(yīng)都有一個(gè)最適宜的pH值[13]，此外，不同的反應(yīng)條件對酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有著不同的影響，從而使產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的清除DPPH自由基的活性[12]。由圖3可知，當(dāng)pH值為2.5時(shí)酶解液的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，隨著pH值繼續(xù)升高，活性下降并逐漸趨于平緩。本實(shí)驗(yàn)旨在得到活性高的多肽片段，因此選擇pH2.5作為較適pH值。

2.1.4 底物質(zhì)量濃度對抗氧化活性的影響

圖4 底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，酶解液的DPPH自由基清除率先增大后減小，在0.06g/mL左右達(dá)到最大。在低質(zhì)量濃度時(shí)，溶液太稀不利于酶分子與蛋白質(zhì)分子相互作用，而實(shí)際生產(chǎn)也希望底物質(zhì)量濃度較大，獲得較多的活性多肽；但是質(zhì)量濃度過高，溶液比較黏稠，也會(huì)阻礙酶與蛋白之間的充分作用[14]，故初步確定酶解體系的較適底物質(zhì)量濃度為0.06g/mL。

2.1.5 酶解時(shí)間對抗氧化活性的影響

圖5 酶解時(shí)間對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on DPPH free radicalscavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

由圖5可知，從2～4h時(shí)，DPPH自由基清除率顯著增大，4h以后增加緩慢。由于在反應(yīng)的初始階段，蛋白酶活力最強(qiáng)，能與底物充分結(jié)合，而且底物質(zhì)量濃度最大，酶作用位點(diǎn)也最多，此時(shí)反應(yīng)最快，酶解液活性顯著增加。隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，底物質(zhì)量濃度減少，反應(yīng)位點(diǎn)相應(yīng)減少，產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加，對酶催化反應(yīng)起到抑制作用，反應(yīng)達(dá)到某一動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)酶活力也隨時(shí)間的延長而降低[15]。這些因素的綜合作用導(dǎo)致酶解液的活性增加趨于平緩，因此初步選擇較適酶解時(shí)間為4h。

2.2 酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)

酸性蛋白酶酶解南瓜籽蛋白的響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了15組試驗(yàn)，其中3組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。利用Minitab15.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到編碼空間的酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白的三元二次回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the fitted regression model

從該模型的方差分析表3可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)[16]。失擬項(xiàng)在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.167＞0.05)，其決定系數(shù)為0.9918，校正決定系數(shù)為0.9770，說明該模型能解釋97.70%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的2.30%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度良好，用該模型對酸性蛋白酶水解制備南瓜籽抗氧化肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

表4 回歸系數(shù)顯著性分析Table 4 Significance test for each regression coefficient of the fitted regression model

對方程的回歸系數(shù)顯著性分析(表4)表明，試驗(yàn)中常量、A、B、C、B2、C2這幾個(gè)因素對酶解液清除率的影響顯著，表明在酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白過程中，加酶量、酶解時(shí)間、底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率有顯著影響：B2、C2的影響顯著也說明酶解過程中酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度對酶解液的抗氧化活性影響是非線性的。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化[13]

通過上述二次多項(xiàng)回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖和等高線圖見圖6～8。通過該組動(dòng)態(tài)圖即可對任何兩因素交互影響DPPH自由基清除率效應(yīng)進(jìn)行分析與評價(jià)，并從中確定最佳因素水平范圍。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[17]。

圖6顯示了加酶量和酶解時(shí)間對DPPH自由基清除率的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀的看出加酶量和酶解時(shí)間的交互作用不顯著，加酶量在4000～8000U/g pro之間，時(shí)間在4～6h之間存在最高值，DPPH自由基清除率最高值在91%～93%之間。圖7顯示了加酶量和底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的交互影響效應(yīng)，加酶量在3000～8000U/g pro之間，底物質(zhì)量濃度在0.04～0.06g/mL之間存在最高值，DPPH自由基清除率最高值在92%～96%之間。圖8顯示了底物質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間對DPPH自由基清除率的交互影響效應(yīng)，由等高線圖可見，該兩因素對DPPH自由基清除率的交互作用比較顯著，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度約為0.045～0.06g/mL，酶解時(shí)間約為3～6h時(shí)，DPPH自由基清除率最高值在92%～96%之間。

圖6 加酶量和酶解時(shí)間交互影響DPPH自由基清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of enzyme concentration and hydrolysis time on DPPH free radicals cavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

圖7 加酶量和底物質(zhì)量濃度交互影響DPPH自由基清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of enzyme concentration and substrate concentration on DPPH free radical scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

圖8 底物質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間交互影響DPPH自由基清除率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of substrate concentration and hydrolysis time on DPPH free radical scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate

2.2.3 南瓜籽蛋白酶解工藝條件的確定及驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用MINITAB15.0軟件獲得了DPPH自由基清除率最高時(shí)的最佳酶解條件為：酶解溫度5 0℃、pH2.5、酶解時(shí)間4.87h、底物質(zhì)量濃度0.0543g/mL，加酶量6181.82U/g pro，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率的預(yù)測值為93.17%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，考慮到操作的可行性，實(shí)際酶解條件修正為：溫度50℃、酶解pH 2.5、酶解時(shí)間5h、底物質(zhì)量濃度0.05g/mL、加酶量6000U/g pro。

在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，所得DPPH自由基清除率結(jié)果分別為92.15%、93.08% 和93.23%，平均值為92.82%，與預(yù)測值較為接近，證明該模型能較好地預(yù)測南瓜籽酶解液的實(shí)際DPPH自由基清除率效果。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Plackett-Burman篩選試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間三因素為顯著因素，并且優(yōu)化得到酸性蛋白酶水解制備南瓜籽抗氧化肽的最佳酶解條件為加酶量6000U/g pro，底物質(zhì)量濃度0.05g/mL、酶解時(shí)間5h、溫度50℃、pH2.5，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率可達(dá)到92.82%。經(jīng)方差分析得知酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的影響都是顯著的而且是非線性的，而它們之間的交互影響不顯著。實(shí)驗(yàn)證明，響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化酶解制備南瓜籽抗氧化肽的工藝條件，這為進(jìn)一步分離純化南瓜籽抗氧化肽提供了數(shù)據(jù)參考。

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Optimization of Preparation Process for Antioxidant Peptides from Pumpkin Seed by Response Surface Methodology

FAN San-hong，MAO Qiang-qiang ，WANG Ya-yun，F(xiàn)ENG Yu-wei，LIU Yan-rong
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Pumpkin seed protein isolate was hydrolyzed by acidic protease to prepare antioxidant peptides. One-factor-at-atime experiments were done to explore the effects of enzyme concentration, pH, temperature, substrate concentration and hydrolysis time on the scavenging activity of pumpkin seed hydrolysate against DPPH free radicals. Enzyme concentration, susbstrate concentration and hydrolysis time were identified as main affecting parameters and optimized using response surface analysis based on a three-variable, three-level Box-Behnken design. The optimal hydrolysis conditions were determined as hydrolysis temperature of 50 ℃, hydrolysis pH of 2.5, enzyme concentration of 6000 U/g, substrate concentration of 0.05 g/mL and hydrolysis time of 5 h. Under these conditions, the scavenging activity of DPPH free radicals was up to 92.82%.

response surface methodology；pumpkin seed；antioxidant peptide；enzymatic hydrolysis；optimzation

TS255.36；TS218

A

1002-6630(2012)11-0241-06

2011-06-23

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20080311015)；山西省高等學(xué)校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(20111003)

范三紅(1963—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn