枯草芽孢桿菌JMUKC2產(chǎn)肌苷搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

楊尚彤，肖安風(fēng),2,3，倪 輝,2,3，楊遠(yuǎn)帆,2,3，楊 哲，蔡慧農(nóng),2,3,*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)食品微生物與酶工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

枯草芽孢桿菌JMUKC2產(chǎn)肌苷搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

楊尚彤1，肖安風(fēng)1,2,3，倪 輝1,2,3，楊遠(yuǎn)帆1,2,3，楊 哲1，蔡慧農(nóng)1,2,3,*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)食品微生物與酶工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對肌苷生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌JMUKC2的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖140g/L、玉米漿20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸銨20g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、KH2PO4 7g/L、CaCO3 20g/L。培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，生物量比優(yōu)化前提高了40.67%，肌苷產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了46.57%。

肌苷；枯草芽孢桿菌；搖瓶發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化

肌苷(inosine)又稱次黃嘌呤核苷，其分子式為C10H12N4O5，相對分子質(zhì)量為268.23[1]。肌苷在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著非常重要的用途：它是食品中較好的呈味物，其含量常常作為衡量食品“新鮮度”的特征指標(biāo)之一；它是食品工業(yè)中5,-肌苷酸的原料，同時(shí)也是各種調(diào)味食品(例如味精、醬油等)的營養(yǎng)助鮮劑[2]。在醫(yī)藥上它能預(yù)防及解除由血防藥物引起的對心臟或肝臟的副作用[3-5]，是治療冠心病、肝炎、白血球減少癥等的良效藥物；同時(shí)也是抗生素生產(chǎn)的重要原料[6]。但是，近年來隨著韓國、日本等生產(chǎn)廠家對中國市場的沖擊，國內(nèi)的核苷發(fā)酵產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，為此提高發(fā)酵得率、降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)能力已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急[7]。

目前，提高肌苷產(chǎn)量的方法主要包括誘變育種[8-9]、基因工程改造菌種[10]、發(fā)酵條件優(yōu)化[11]等。吳江等[9]通過NTG誘變的方法得到的B. subtilis IFO14189可以積累肌苷15g/L，然而這樣可能會(huì)引起一些不必要的負(fù)突變而且耗時(shí)、低效；基因工程技術(shù)是一種新興的技術(shù)手段，Shimaoka等[10,12]報(bào)道了關(guān)鍵基因中斷技術(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用，其中關(guān)鍵基因edd (6-磷酸葡萄糖脫氫酶的關(guān)鍵基因)和pgi (6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的關(guān)鍵基因)的中斷有利于肌苷的積累，但基因工程技術(shù)不易操作且成本較高；而發(fā)酵條件的優(yōu)化是較為簡單且成本較低的實(shí)驗(yàn)手段[11]。肌苷發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，優(yōu)良生產(chǎn)菌種的選育固然是肌苷發(fā)酵的關(guān)鍵，但發(fā)酵條件的控制對肌苷發(fā)酵也有很大的影響[13-14]。樊國燕[15]采用四因素三水平正交試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，考察了葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4對產(chǎn)苷的影響，優(yōu)化后的肌苷產(chǎn)量比優(yōu)化前的肌苷產(chǎn)量提高了20.14%；呂東坡等[6]采用七因素三水平正交試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并確定了其發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方；徐詠全等[16]利用模式識別法對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以培養(yǎng)基組成為特征變量構(gòu)筑模式空間，以肌苷產(chǎn)量為評價(jià)目標(biāo)，通過主成分分析法線性映射，在優(yōu)類區(qū)域?qū)c(diǎn)逆推回高維空間，得到最優(yōu)的培養(yǎng)基配方，將肌苷產(chǎn)量提高了26.8%；常景玲等[17]對選育出的優(yōu)良菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的肌苷產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.5%。

在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，由集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室提供的枯草芽孢桿菌(CICC 20958)經(jīng)紫外誘變篩選獲得了一株高產(chǎn)肌苷的生產(chǎn)菌種枯草芽孢桿菌JMUKC2，并在-70℃條件下于體積分?jǐn)?shù)20%的甘油中保存。本實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)基的基本成分入手，利用單因素試驗(yàn)并結(jié)合正交試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌JMUKC2的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)完整地優(yōu)化，確定了其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，提高了肌苷產(chǎn)量，并為后續(xù)罐上工藝的開發(fā)提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) JMUKC2由集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室提供的枯草芽孢桿菌(CICC 20958)經(jīng)紫外誘變篩選獲得，并在-70℃條件下于20%的甘油中保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.2；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉15、玉米漿12、NaCl 2.5、尿素 2，pH 7.2；初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖140、酵母膏15、玉米漿16、尿素13、硫酸銨22、MgSO4·7H2O 2、K2HPO45、CaCO320，pH 7.0。

1.3 試劑與儀器

硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；酵母膏 英國Dxoid公司；玉米漿(含47.5%干物質(zhì)) 廈門匯盛生物有限公司；肌苷標(biāo)準(zhǔn)美國Sigma公司；甲醇(色譜純) 美國天地公司。

Waters 2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；ZHWY-2102雙層全溫度恒溫?fù)u床 上海智誠實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS223S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Minispin高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保存的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18h。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

從活化18h的斜面培養(yǎng)基上取一環(huán)菌種轉(zhuǎn)接到裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，220r/min、34℃培養(yǎng)18h。

1.3.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

取培養(yǎng)18h的新鮮種子液，以5%接種量接入裝有25mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，220r/min、34℃培養(yǎng)72h。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 生物量測定[18]

取0.2mL的發(fā)酵液用蒸餾水稀釋30倍，以蒸餾水作空白，用分光光度計(jì)在660nm波長處測定其光密度值，用此光密度值表示生物量。

1.3.4.2 肌苷產(chǎn)量測定[19]

采用HPLC法，色譜柱Symmetry型C18反相柱(4.6mm×150mm，3.5μm)，色譜條件：流動(dòng)相為A：超純水(含0.5%磷酸)；B：甲醇。梯度程序?yàn)椋?～3min，100% A；3～9min，92% A，8% B；9～11min，100% B；11～12.42min，100% A。波長：248nm；流速：0.60mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析(顯著水平α＝0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響

2.1.1 碳源種類的影響

枯草芽孢桿菌為化能異養(yǎng)菌，碳源對其生長代謝會(huì)有非常重要的作用。碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，其主要作用構(gòu)成菌體和合成肌苷的碳架及能量來源[20]。一般的微生物可以在含各種碳水化合物的培養(yǎng)基上良好生長，但它們產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和碳源的種類有很大關(guān)系。保持搖瓶發(fā)酵初始培養(yǎng)基的其他成分不變，固定各碳源含碳量為50.91g/L(以葡萄糖計(jì))，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油為碳源，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，比較不同碳源對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源種類對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響Fig.1 Effect of carbon source on inosine production during fermentation

由圖1可知，當(dāng)以葡萄糖作碳源時(shí)，菌體的生物量及肌苷產(chǎn)量均達(dá)到最大，其中肌苷產(chǎn)量比蔗糖作碳源時(shí)的肌苷產(chǎn)量高出11.84%，比麥芽糖高出11.14%，比可溶性淀粉高出229.36%，比甘油高出84.10%，故確定其最佳碳源種類為葡萄糖。由于適宜的葡萄糖為菌體的生長既可以提供碳源，又可以提供能量，故菌體生長旺盛，為肌苷生產(chǎn)菌的產(chǎn)苷奠定良好的基礎(chǔ)；同時(shí)又可以保證充足的能量供產(chǎn)苷期利用，以盡量發(fā)揮菌種的產(chǎn)苷潛力，能夠較好的滿足菌體生長和產(chǎn)苷的需要，因此，以葡萄糖為碳源。

2.1.2 不同葡萄糖質(zhì)量濃度的影響

圖2 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on inosine production during fermentation

由圖2可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，肌苷產(chǎn)量和生物量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為140g/L時(shí)，生物量和肌苷產(chǎn)量均達(dá)到最大，其中肌苷產(chǎn)量達(dá)到2.94g/L。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度大于140g/L時(shí)，肌苷產(chǎn)量和生物量又呈現(xiàn)下降的趨勢，故培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的葡萄糖有利于肌苷的發(fā)酵，葡萄糖質(zhì)量濃度過高，可能會(huì)使枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生較多的酸類[21-22]；同時(shí)導(dǎo)致菌體細(xì)胞滲透壓增大，對菌體生長和發(fā)酵均有不利影響，不利于肌苷的積累。因此，選擇初始葡萄糖質(zhì)量濃度140g/L進(jìn)行下一步研究。

2.2 不同氮源質(zhì)量濃度對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響

氮源不僅是構(gòu)成枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)合成的來源，而且也是肌苷堿基部分合成的來源[20]。由于該發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源成分較為復(fù)雜，根據(jù)枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵特性的研究，確定所要考察的4種組分為：酵母膏、玉米漿、尿素、硫酸銨，對此選擇四因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，所得肌苷產(chǎn)量與極差分析結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of combined nitrogen sources

由表1極差分析可知，酵母膏對肌苷生產(chǎn)菌JMUKC2生產(chǎn)肌苷的影響最為顯著，其次依次為尿素、玉米漿、硫酸銨。由均值分析可知，培養(yǎng)基氮源最優(yōu)組合為：A3B3C1D2。按照確定的培養(yǎng)基氮源最優(yōu)組合A3B3C1D2以及9組正交試驗(yàn)中肌苷產(chǎn)量最大組即第6試驗(yàn)組A2B3C1D2進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果顯示A3B3C1D2產(chǎn)肌苷為4.27g/L大于A2B3C1D2組合下的肌苷產(chǎn)量(4.01g/L)，故可確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)肌苷的最優(yōu)氮源組合為A3B3C1D2，即酵母膏17g/L、玉米漿20g/L、尿素7g/L、硫酸銨20g/L。

2.3 磷酸鹽對枯草芽孢菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響

2.3.1 磷酸鹽種類的影響

無機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)中所不可缺少的物質(zhì)：可以構(gòu)成菌體成分；作為酶的激活劑或抑制劑；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓以及調(diào)節(jié)pH值和氧化還原電位等[23]。本實(shí)驗(yàn)按初始培養(yǎng)基配比，恒定CaCO3加入量20g/L，考察磷酸鹽和鎂離子對枯草芽孢桿JMLIKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響。保持培養(yǎng)基的其他成分不變，固定各磷酸鹽含磷量0.89g/L(以KH2PO4計(jì))，分別以K2HPO4、KH2PO4、K2HPO4＋KH2PO4為磷酸鹽，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，比較不同磷酸鹽對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同磷酸鹽種類對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響Fig.3 Effect of phosphate type on inosine production during fermentation

由圖3可知，培養(yǎng)基中單獨(dú)添加KH2PO4時(shí)肌苷產(chǎn)量和生物量均達(dá)到最大，其中生物量比K2HPO4所得生物量高出7.74%，比等量的K2HPO4和K0H2PO4所得生物量高出9.24%；單獨(dú)添加KH2PO4時(shí)肌苷產(chǎn)量為4.59g/L，比KH2PO4所得肌苷產(chǎn)量高出4.08%，比添加等量的K2HPO4和KH2PO4所得肌苷產(chǎn)量高出19.22%。KH2PO4在菌體生長、繁殖和代謝活動(dòng)中起著非常重要的作用：一方面，KH2PO4提供的磷是構(gòu)成核酸磷脂、許多輔酶或輔基(輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料[24]；另一方面，KH2PO4在代謝調(diào)節(jié)方面也起著重要的作用，能促進(jìn)糖代謝的進(jìn)行，有利于微生物的生長[25]。因此，磷酸鹽是枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中另一個(gè)重要的組成成分，它的濃度大小直接影響著枯草芽孢桿菌菌體的生長和芽孢的形成。

2.3.2 不同質(zhì)量濃度KH2PO4的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度KH2PO4對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響Fig.4 Effect of KH2PO4 concentration on inosine production during fermentation

由圖4可知，隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增大，枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵72h后的生物量和所得肌苷產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中當(dāng)培養(yǎng)基中KH2PO4的質(zhì)量濃度為7g/L時(shí)生物量和肌苷產(chǎn)量均達(dá)到最大：OD660nm值為24.53，比優(yōu)化前提高了10.12%；肌苷產(chǎn)量為4.48g/L，比優(yōu)化前提高了10.12%。KH2PO4的添加能解除ATP 對1,6-二磷酸果糖激酶的抑制，而磷酸果糖激酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶[25]，因而KH2PO4的添加可以改變枯草芽孢桿菌肌苷合成途徑中的代謝流分布，進(jìn)而增大了肌苷合成的代謝通量，實(shí)現(xiàn)肌苷產(chǎn)量的增加。因此，選擇7g/L的KH2PO4進(jìn)行下一步研究。

2.4 不同質(zhì)量濃度的鎂離子對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響

基于上述培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)果(葡萄糖140g/L、玉米漿20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸銨20g/L、KH2PO47g/L)，分別考察0、1、2、3、4g/L的硫酸鎂對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O對枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O concentration on inosine production during fermentation

由圖5可知，隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的增大，枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵72h后的生物量和所得肌苷產(chǎn)量大體上均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中當(dāng)培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的添加質(zhì)量濃度在1g/L時(shí)生物量和肌苷產(chǎn)量均達(dá)到最大，OD660nm值比優(yōu)化前提高了4.12%；肌苷產(chǎn)量達(dá)到了4.50g/L，比優(yōu)化前提高了23.97%。由于Mg2+能與ATP結(jié)合形成ATP復(fù)合物，此復(fù)合物對己糖激酶(HK)有很強(qiáng)的激活作用，加快了6-磷酸葡萄糖的合成速率[26]，從而加快了肌苷合成的速率；但過多Mg2+的添加容易和微生物的蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)生變性或沉淀[27]，對枯草芽孢桿菌的生長和發(fā)酵均有不利影響。因此，添加適量的Mg2+有利于肌苷的積累。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后肌苷產(chǎn)量對比

通過以上實(shí)驗(yàn)，初步優(yōu)化得到了枯草芽孢桿菌JMUKC2產(chǎn)肌苷的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖140g/L、玉米漿20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸銨20g/L、KH2PO47g/L、MgSO4·7H2O 1g/L。在此條件下，與最初的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后肌苷產(chǎn)量的對比Fig.6 Comparisons of inosine production biomass before and after the optimization

由圖6可知，枯草芽孢桿菌JMUKC2在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后， OD660nm值為17.17，肌苷產(chǎn)量可達(dá)4.91g/L，比初始培養(yǎng)基分別提高了40.67%和46.57%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，采用較少的實(shí)驗(yàn)找出各因素之間的相互關(guān)系，對肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌JMUKC2發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為：葡萄糖 140g/L、酵母膏17g/L、玉米漿20g/L、尿素7g/L、硫酸銨20g/L、KH2PO47g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、CaCO320g/L。優(yōu)化后的生物量和肌苷產(chǎn)量均比優(yōu)化前有較大的提高：比初始培養(yǎng)基分別提高了40.67%和46.57%。

[1]徐詠全. 肌苷產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件研究[D]. 天津: 天津科技大學(xué), 2004.

[2]尚四華. 肌苷和肌苷酸測定的新方法研究[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊, 2001, 37(10): 463-464.

[3]ABBOUNI B, ELHARIRY H, GEORG A. Overproduction of NAD+and 5,-inosine monophosphate in the presence of 10 μ M Mn2+by a mutant of Corynebacterium ammoniagenes with thermosensitive nucleotide reduction (nrdts) after temperature shift[J]. Arch Microbiol, 2004, 182(4): 119-125.

[4]LI Haojian, ZHANG Guoqiang, DENG Aihua, et al. De novo engineering and metabolic flux analysis of inosine biosynthesis in Bacillus subtilis[J]. Biotechnol Lett, 2011, 33(2): 1575-1580.

[5]氨基酸·核酸集談會(huì). 核酸發(fā)酵[M]. 張克旭, 杜連祥, 譯. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1987: 175-188.

[6]呂東坡, 呂廣磊, 劉芳芳, 等. 肌苷發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[J]. 中國食品添加劑, 2008, 6(2): 161-166.

[7]陳雙喜. 肌苷多尺度發(fā)酵過程[D]. 上海: 華東理工大學(xué), 2005.

[8]賈紅華, 周華, 韋萍. 微波誘變育種研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 工業(yè)微生物, 2003, 33(2): 46-50.

[9]吳江, 黃為一, 陳曉路. 肌苷產(chǎn)生菌HW-9的選育[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 17(2): 66-69.

[10]SHIMAOKA M, KAWASAKI H, TAKENAKA Y, et al. Effects of edd and pgi disruptions on inosine accumulation in Escherichia coli[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 69(7): 1248-1255.

[11]施慶珊, 李良秋, 林小平, 等. 產(chǎn)氨短桿菌GMA-2802 1.2L罐肌苷發(fā)酵試驗(yàn)[J]. 生物學(xué)雜志, 2002, 18(2): 13-14.

[12]SHIMAOKA M, TAKENAKA Y, MIHARA Y, et al. Effects of χapA and guaA disruption on inosine accumulation in Escherichia coli[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(12): 3069-3072.

[13]HUI Ming, SUN Junliang, ZHANG Xingyuan. Study on fermentation process conditions of excess synthetic riboflavin by Eremothecium ashbyii T30[J]. Feed Res, 2000, 3(1): 13-16.

[14]郝林華, 孫丕喜, 姜振波, 等. 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)液體發(fā)酵條件[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2006, 24(4): 380-385.

[15]樊國燕. 肌苷發(fā)酵條件及含量分析研究[J]. 鄭州牧專學(xué)報(bào), 1998, 18 (2): 5-9.

[16]徐詠全, 張蓓, 趙蕊, 等. 肌苷發(fā)酵培養(yǎng)基的模式識別法優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2003, 18(3): 105-108.

[17]常景玲, 任敏. 肌苷菌種的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2002, 21(12): 29-32.

[18]柏建新, 鄧崇亮, 錢養(yǎng)釗, 等. 肌苷產(chǎn)生菌缺失核苷水解酶活性突變株選育及其發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 27(3): 11-15.

[19]吳波, 張寒俊. 高效液相色譜分析啤酒中的肌苷、肌苷酸[J]. 中國釀造, 2007, 26(2): 56-58.

[20]張麗霞. 枯草芽孢桿菌B908發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[21]沈同, 王鏡巖. 生物化學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1998.

[22]張?jiān)撇? 孫謐. 黃海黃桿菌YS-9412-130產(chǎn)酸發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2010, 21(4): 26-35.

[23]BALTER M. Protein matchmaker may lead new gene therapy to the alter [J]. Science, 1996, 273: 183.

[24]龐勇, 李斌, 呂頌輝. 不同磷源對海洋卡盾藻生長和堿性磷酸酶活性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(17): 9146-9148.

[25]趙春光, 謝希賢, 徐慶陽, 等. 磷酸鹽對Escherichia coli TRJH L-色氨酸發(fā)酵代謝流分布的影響[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 24(5): 10-14.

[26]歐陽平凱, 應(yīng)漢杰. 金屬離子對1,6-二磷酸果糖合成代謝流量的影響[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2008, 14(5): 443-446.

[27]劉國生, 李學(xué)梅, 李用芳, 等. 六種金屬離子對Bacillus subtilis肌苷產(chǎn)率的影響[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2009, 34(8): 385-388.

Culture Medium Optimization for Inosine Production by Bacillus subtilis JMUKC2 in Shake Flasks

YANG Shang-tong1，XIAO An-feng1,2,3，NI Hui1,2,3，YANG Yuan-fan1,2,3，YANG Zhe1，CAI Hui-nong1,2,3,*
(1. College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology, Jimei University, Xiamen 361021, China；3. Food Bioenginering Research Center of Xiamen, Xiamen 361021, China)

This paper describes the optimization of the fermentation medium for inosine-overproducing Bacillus subtilis JMUKC2 in shakes flask using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The optimal fermentation medium was composed of 140 g/L glucose, 20 g/L corn liquor, 17 g/L yeast, 7 g/L urea, 20 g/L ammonium sulfate, 1 g/L MgSO4·7H2O, 7 g/L KH2PO4and 20 g/L CaCO3. The resulting biomass and inosine production were increased by 40.67% and 46.57% compared with those before the optimization, respectively.

inosine；Bacillus subtilis；shake flask fermentation；culture medium optimization

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0167-05

2012-02-24

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011J01225)；集美大學(xué)中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)(2010A006)；集美大學(xué)科研基金項(xiàng)目(2010N5009)

楊尚彤(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：yangshangtong@yahoo.com.cn

*通信作者：蔡慧農(nóng)(1957—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程。E-mail：huinongcai@163.com