人工免疫組化的注意事項(xiàng)及影響因素

李建國 陳善紅

免疫組織化學(xué)(IHC)是在1941年由微生物學(xué)家AH Coons起步的，在1976年Melistain及Kohler發(fā)明單克隆抗體技術(shù)以來得到了極大的發(fā)展。我國自1980年在國內(nèi)逐步開展以來，至今已普遍應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)院的病理診斷中，不僅在部分疑難病例的診斷與鑒別診斷中起著決定性的作用，而且對(duì)臨床的介入越發(fā)深入，在腫瘤的預(yù)后判斷、臨床處理、治療反應(yīng)尤其是靶向治療方面發(fā)揮著不可替代的重大作用。我院自上世紀(jì)九十年代開展人工免疫組化技術(shù)以來，至今已完成3000余例。現(xiàn)將我院在人工免疫組化工作當(dāng)中的心得體會(huì)與大家做一探討。

1 免疫組化實(shí)驗(yàn)原理與過程

免疫組化繼承了組織化學(xué)用顏色代表化學(xué)成分的傳統(tǒng)，全過程包括:首先從已知組織細(xì)胞中提取出抗原，然后通過免疫動(dòng)物獲得特異性抗體，繼而把純化的抗體標(biāo)記上示蹤劑(可用熒光劑或過氧化物酶)，最后一步則是把標(biāo)記的抗體與欲檢測(cè)的組織反應(yīng)(染色)。免疫組化反應(yīng)的位置抗原在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核甚至是在某一個(gè)細(xì)胞器上，有明確的定位，因而假如組織細(xì)胞某個(gè)部位出現(xiàn)抗體所帶的染色，那就表明該處是抗體所在部位，也就是抗原所在的位置，從而證明所檢測(cè)的組織細(xì)胞中有相關(guān)的化學(xué)成分，因而可以定性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各種微生物、蛋白、多糖、核酸甚至DNA、RNA基因表達(dá)產(chǎn)物，在一定程度上可以說明組織細(xì)胞的代謝途徑和功能作用。因而免疫組化是以形態(tài)學(xué)為主，形態(tài)、代謝、功能相結(jié)合的三位一體的科學(xué)［1］。

1.1 組織的處理 免疫組化反應(yīng)抗原的準(zhǔn)確顯示與定位制備的組織細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量的好壞密切相關(guān)。組織固定應(yīng)及時(shí)充分，及時(shí)的固定不僅可使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，終止外/內(nèi)源性酶活性，并可最大限度地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散。大塊組織應(yīng)及時(shí)平行多刀剖開固定，時(shí)間以12～24 h為宜，固定劑首選10%中性福爾馬林，組織塊應(yīng)選取新鮮無出血壞死并有代表性者，不宜過大過厚，必須小于2 cm×1.5 cm×0.3 cm，厚度≤0.3 cm，微小組織和液體沉淀物先用濾紙妥為包裹后固定。固定液體積一般大于組織20倍以上。

1.2 防脫玻片的處理 以前應(yīng)用普通載玻片清洗后涂以多聚-L-賴氨酸防脫劑自己制作防脫片，現(xiàn)在國內(nèi)病理科內(nèi)已普遍應(yīng)用免疫組化專用的商業(yè)防脫黏膠載玻片，質(zhì)量穩(wěn)定，開盒即用，已無需再處理。

1.3 包埋與切片 過熱的石蠟液包埋容易破壞潰瘍，宜選用低熔點(diǎn)的石蠟(熔點(diǎn)＜60℃)。切片厚度需在3～5 μm，宜薄不宜厚，過厚的切片不僅影響免疫反應(yīng)，而且影響鏡下觀察。

1.4 抗原修復(fù)(AR) 組織細(xì)胞經(jīng)福爾馬林固定后，抗原結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)發(fā)生顯著改變，表位空間結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致許多抗原活性消失。通過一定的方法可以使組織抗原表位再次充分暴露，重現(xiàn)抗原的原有活性。目前，加熱修復(fù)抗原是絕大多數(shù)抗原最有效的修復(fù)方法，但少數(shù)抗原需采用酶消化法。加熱修復(fù)方法主要包括:高壓法、微波法、水溶法等，實(shí)驗(yàn)顯示修復(fù)效果為高壓法＞水溶法＞微波法。需注意的是沒有一種抗原修復(fù)液能適用于所有的抗體，因此需根據(jù)抗體選用合適的抗原修復(fù)液。

1.5 內(nèi)源性生物素的封閉 在免疫組化中若采用過氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，必須滅活過氧化物酶，否則組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞可能會(huì)干擾染色結(jié)果的判斷。一般采用3%H2O2封閉效果比較顯著，有時(shí)也在加一抗之前實(shí)驗(yàn)封閉血清，選擇的血清種屬一般與二抗的種屬相同，以減少非特異性顯色。一抗中若含有正常血清可免去此步驟。

1.6 沖洗 用于除去組織中的AR液、未被特異性結(jié)合的一抗和二抗并調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的pH環(huán)境。要求在操作中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)沖洗步驟，動(dòng)作輕緩，水流不得直對(duì)組織以防止脫片;沖洗次數(shù)與時(shí)間應(yīng)足夠。

1.7 滴加試劑及孵育事項(xiàng) 包括滴加一抗、二抗與顯色劑。輕輕傾去液，用濾紙吸干組織周圍液體，輕輕蘸取組織表面水分(但絕對(duì)不能擦);滴加試劑量要適中，把火柴桿尾端壓片并展開，用之將試劑輕輕攤開至組織外1～2 mm，液面厚1 mm左右，注意操作過程中不能碰到組織，若有氣泡可直接刺破或點(diǎn)走以免出現(xiàn)氣泡下假陰性反應(yīng)?？贵w孵育的溫度以25℃ ±8℃為準(zhǔn)，時(shí)間約為30～60 min，?？贵w孵育應(yīng)在潮濕封閉的環(huán)境中進(jìn)行，避免抗體試劑水分蒸發(fā)造成抗體濃縮干燥致使全片著色，因此高質(zhì)量的孵育盒是免疫組化的必要實(shí)驗(yàn)用品。需要注意的是試劑的濃度、孵育溫度和孵育時(shí)間是相互關(guān)聯(lián)的，濃度與溫度和時(shí)間基本成反比，即孵育濃度越高，孵育溫度就應(yīng)該越低，孵育時(shí)間就應(yīng)該越短，反之亦然。試劑英避免長(zhǎng)時(shí)間置于室溫中，盡量減少溶凍次數(shù)，防止效價(jià)下降。

1.8 顯色 DAB(棕色)顯色劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，30 min內(nèi)用完。若切片量大時(shí)英分次配制分批顯色。顯色時(shí)間3～5 min，可根據(jù)溫度和切片整體顯色情況決定顯色時(shí)間。一般顯色時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)顯色過深或背景著色，時(shí)間過短則會(huì)出現(xiàn)顯色過淺或假陰性;尤其對(duì)部分需要定量報(bào)告的抗體如Ki-67、PR、ER、Her-2等更需細(xì)心觀察，逐一適時(shí)終止反應(yīng)。

2 影響免疫組化染色的常見因素

2.1 組織損傷 如機(jī)械損傷、電烙手術(shù)損傷、組織變干，無論是組織固定欠佳還是染色過程中試劑覆蓋組織欠佳，皆會(huì)導(dǎo)致組織變干后蛋白變性，抗原性喪失，表現(xiàn)為無色片或全片著色。

2.2 組織固定不理想 組織固定的好壞直接與抗原的保存有關(guān)，組織固定不及時(shí)，固定液的種類和濃度不恰當(dāng)，固定時(shí)間過短過長(zhǎng)皆會(huì)影響染色效果。

2.3 組織處理不當(dāng) 在組織脫水、浸蠟、包埋、烤片過程中時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致抗原丟失。掌握的原則是:在石蠟?zāi)軌蛉刍那疤嵯?，溫度越低抗原保存越好，而烤片溫度常?guī)在60℃，時(shí)間為1 h。

2.4 抗原修復(fù)不足 目前免疫組化染色結(jié)果不佳的主要原因是抗原修復(fù)不足。目前常用的高壓鍋法，應(yīng)在噴氣后再維持1.5～2 min。

2.5 抗體試劑質(zhì)量問題 目前各公司生產(chǎn)的抗體一般都能保證產(chǎn)品質(zhì)量，但由于運(yùn)輸、分裝、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)皆會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此買回抗體后應(yīng)進(jìn)行測(cè)試確認(rèn)不存在質(zhì)量問題。

2.6 染色技術(shù)問題 免疫組化染色步驟繁多，任何一步出問題都會(huì)導(dǎo)致染色失敗，而且染色效果與室溫密切相關(guān)，因此操作者不僅應(yīng)具有很強(qiáng)的責(zé)任心，而且在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室具體情況摸索出一套適合自己的工作規(guī)程。

［1］周會(huì)芹，楊江輝，余琦，等.不同組織固定液對(duì)免疫組化結(jié)果的影響.診斷病理學(xué)雜志，2009，16(6):478.