萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽提取工藝的優(yōu)化

楊映霞 孟多佳 孫玉濱 于偉華 奚東玲

萊菔子為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L的干燥成熟種子。其主要功效是消食除脹、降氣化痰［1］。萊菔子中主含萊菔素(Raphanin)，芥子堿(Sinapine)，芥酸(erucicacia)，亞油酸，植物甾醇等。其中，芥子堿是其降壓作用的活性成分之一。實驗表明，萊菔子中芥子堿多以芥子堿硫氰酸鹽(Sinapinethiocyanate)的形式存在［2］。因此，測定芥子堿硫氰酸鹽的含量對于控制藥材質(zhì)量和制劑的質(zhì)量標(biāo)準制定具有較重要的意義。筆者在參考有關(guān)文獻［3-4］的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計優(yōu)化最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 一般材料 島津10ATvp高效液相色譜系統(tǒng)(二元泵 柱溫箱AT-330，檢測器SPD-10ATvp，浙江大學(xué)N-2000色譜工作站LC-10ATvp)、超聲波清洗器(型號KH-250，功率250 W，工作頻率50 Hz，昆山禾創(chuàng)超生儀器有限公司)。

1.2 試藥 萊菔子藥材購自長春市藥材公司，經(jīng)鑒定為正品;芥子堿硫氰酸鹽對照品(111702-200501中國生物制品所鑒定所);水為哇哈哈純凈水;乙腈為色譜純;其他均為分析純。

表1 正交試驗因素水平

1.3 正交試驗 以芥子堿硫氰酸鹽作為考察指標(biāo)，對萊菔子提取和干燥過程中影響較大的加水量(A)溶劑PH(B)干燥溫度(C)提取次數(shù)(D)4個因素進行考察，每個因素設(shè)3個水平，采用L9(34)正交設(shè)計。(表1)

1.4 芥子堿硫氰酸鹽含量測定［4］

1.4.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX XDB C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 ml加十二烷基磺酸鈉0.1 g)(32∶68)為流動相;檢測波長326 nm;柱溫30℃;理論塔板數(shù)不低于5000;進樣量5 μl。

1.4.2 對照品溶液制備 取芥子堿硫氰酸鹽對照品，精密稱定，加流動相制成每1 ml含10.08 μg的溶液。

1.4.3 供試品溶液制備 取正交試驗樣品6 g，研細，取0.5008 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超生處理30 min，放冷;用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘渣加流動相溶解并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液;即得。

1.4.4 標(biāo)準曲線的繪制 分別吸取濃度為10.08 ug/ml的對照品溶液2、5、7、10、12 ul注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖，測定其峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，芥子堿硫氰酸鹽濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準曲線，并計算回歸方程:Y=12546 X+361.49，r=0.9999 。結(jié)果表明，在0.02 ～0.12 ng/ml時，芥子堿硫氰酸鹽濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗結(jié)果 按正交設(shè)計L9(34)提取藥材，合并濾液，濃縮醇沉。減壓干燥，粉碎，得正交試驗樣品粉末，按“1.4.4”測定樣品中芥子堿硫氰酸鹽的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對芥子堿硫氰酸鹽提取影響大小為B＞C＞D＞A最佳提取工藝為B2C1D2A3即取藥材加溶劑pH值為5.5，浸膏干燥溫度60℃，提取3次;藥材為10倍量水，干膏粉碎即得。方差分析表明，B、C因素對芥子堿硫氰酸鹽影響顯著(P＜0.05)，D、A因素在考察范圍內(nèi)影響較小，無顯著性影響，考慮到生產(chǎn)成本問題優(yōu)選工藝為B2C1D2A1。

2.2 驗證實驗 由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計表的9次試驗中，故對其進行驗證實驗。用同一批藥材按照前述的提取干燥過程，按B2C1D2A1工藝條件進行試驗3次，結(jié)果見表3，由表3可知此工藝基本穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 驗證試驗結(jié)果

3 討論

3.1 芥子堿是萊菔子中降壓作用的有效成分，在許多以萊菔子為君藥的中藥制劑中，均采用芥子堿硫氰酸鹽作為主要考察指標(biāo)，同時對控制藥材質(zhì)量也有一定的意義。故該試驗也選用芥子堿硫氰酸鹽作為提取工藝篩選的優(yōu)化指標(biāo)。

3.2 在試驗中發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽在室溫光照條件下，穩(wěn)定性較差，易被破壞。因此，應(yīng)盡可能的在短時間內(nèi)測定，以免試劑分解影響結(jié)果。

3.3 本實驗采用水作為生產(chǎn)提取溶劑，優(yōu)化提取工藝，價格便宜，方法簡單，操作簡便安全，適合應(yīng)用于工業(yè)化。

［1］國家藥典委員會.中國藥典一部.中國醫(yī)藥科技出版社，2010:256.

［2］劉麗芳，王宇新，張新勇，等.萊菔子中芥子堿的含量測定.中成藥，2002，(2):52.

［3］丁臻，蔡梅超，周洪雷，等.正交試驗法優(yōu)選萊菔子水溶性生物堿提取工藝.食品與藥品，2011，13(1):19-21.

［4］譚鵬，姜虹玉，呂文海.萊菔子研究概況.實用中醫(yī)藥雜志，2005，21(4):254-255.