人自體血清支持臍血源HSCs和MSCs共培養(yǎng)研究

宋 克 東， 劉 天 慶＊， 殷 軼 群， 郭 文 華， 方 美 云，石 芳 鑫， 朱 麗 麗， 吳 筱 婷， 馬 學(xué) 虎， 崔 占 峰

（1.大連理工大學(xué) 化工學(xué)院 干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧 大連 116024；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 血液科，遼寧 大連 116011；3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011；4.牛津大學(xué) 工程科學(xué)系 組織工程與生物處理中心，英國 牛津 OX1 3PJ）

0 引 言

對造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的不斷研究證明，其可以廣泛應(yīng)用在基因治療、骨髓移植及腫瘤凈化等方面[1]，特別是HSCs移植可應(yīng)用在癌癥患者放化療后的造血功能重建中.但是HSCs在臨床上卻沒有得到廣泛應(yīng)用，原因之一就是干細(xì)胞數(shù)量有限[2，3]，對其進(jìn)行體外規(guī)?；瘮U(kuò)增是解決此問題的有效方法.另外，雖然HSCs移植對癌癥患者放化療后的生命質(zhì)量有顯著的改善作用，但由此因短期內(nèi)嚴(yán)重嗜中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥等所帶來的痛苦卻是絕大多數(shù)患者不可避免要承受的，因此改善細(xì)胞質(zhì)量，降低這些并發(fā)癥的發(fā)生是十分必要的.

目前，已有研究證明了間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有體外支持造血發(fā)生的功能，同時在NOD/SCID小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，也證明了在同時移植HSCs和MSCs的情況下，對小鼠造血功能的重建有加速作用[4].而且聯(lián)合移植自體的MSCs對于臨床乳腺癌患者在化療后進(jìn)行的造血干細(xì)胞移植，同樣具有促進(jìn)造血重建的作用，與此同時，還有助于降低伴隨HSCs移植而引起的并發(fā)癥的發(fā)病率.除此之外，MSCs也可作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞和基因治療的載體細(xì)胞.

HSCs可來源于臍帶血（umbilical cord blood，UCB）、骨髓及外周血等，相對于后兩者，來源于UCB的HSCs不僅富含更早期的造血干/祖細(xì)胞，同時具有采集和保存容易、免疫原性弱、對異源性抗原產(chǎn)生的抗體少、無腫瘤細(xì)胞污染、對供者無損傷及副作用、成熟性T細(xì)胞較少、CD34＋CD38－與CD34＋CD33－的比例較高、來源廣泛且移植過程中可以降低移植物抗宿主?。℅VHD）發(fā)生率等諸多優(yōu)點(diǎn)[5].另外，UCB中還含有MSCs，這就使得與臍帶血有關(guān)的干/祖細(xì)胞成為了研究的熱點(diǎn).在同一個培養(yǎng)體系內(nèi)使UCB中的HSCs和MSCs能夠同時培養(yǎng)與收獲，來發(fā)揮臍血庫所保存的臍帶血干細(xì)胞資源應(yīng)用于臨床中的作用，由此帶來的深遠(yuǎn)影響是毫無疑問的.

目前對于臍帶血來源的HSCs與MSCs共培養(yǎng)的研究報道尚少[5].本實(shí)驗(yàn)室范秀波等，在不添加血清，只添加了細(xì)胞因子組合（SCF 15ng·mL－1，TPO 6ng·mL－1，G－CSF 1ng·mL－1，F(xiàn)L 5 ng·mL－1，GM－CSF 5ng· mL－1，IL－3 15 ng·mL－1），同時用AC膠珠包被基質(zhì)細(xì)胞支持的條件下，將微載體與生物反應(yīng)器相結(jié)合，對UCB－HSCs與UCB－MSCs在轉(zhuǎn)瓶及旋轉(zhuǎn)壁式生物 反 應(yīng) 器 （rotating wall vessel bioreactor，RWVB）內(nèi)的共培養(yǎng)進(jìn)行了考察[6].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在RWVB中的擴(kuò)增效果是最優(yōu)的，12d內(nèi)CFU－Cs擴(kuò)增了（5.1±1.2）倍；NCs擴(kuò)增了（3.7±0.3）倍；CD34－CD45－CD105＋（MSCs）細(xì)胞擴(kuò)增了 （13.9±1.2）倍；CD34＋CD45＋CD105－（HSCs）細(xì)胞擴(kuò)增了（5.2±0.4）倍.另外，對骨髓來源的HSCs與MSCs的共培養(yǎng)研究也已處于起步階段.Chen等用培養(yǎng)基MeylocultTM，不添加血清，加入高劑量的細(xì)胞因子組合（SCF 50 ng·mL－1，IL－3 10ng · mL－1，IL－6 10 ng·mL－1），在RWVB內(nèi)令骨髓來源的HSCs和MSCs分別成功擴(kuò)增了8倍和29倍[7].但是，由于Chen等對HSCs與MSCs的共培養(yǎng)采用的是懸浮方式，在分離收獲HSCs與MSCs時存在一定的難度.此外，到目前尚未有采用臍帶血自體血清同時培養(yǎng)和收獲臍帶血中兩種干細(xì)胞方面的研究報道.

由于HSCs懸浮生長，而MSCs具有貼壁生長的生物學(xué)特性，要想模擬體內(nèi)微環(huán)境實(shí)現(xiàn)HSCs和MSCs的共培養(yǎng)，必須兼顧兩者的生長特性，分別提供它們懸浮培養(yǎng)環(huán)境與動態(tài)貼附表面，將微載體與適宜的生物反應(yīng)器結(jié)合是解決此問題的可行方法之一.因變性膠原包被的交聯(lián)葡聚糖（cytodex－3）微載體具有良好的表面貼附特性，在三維動態(tài)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞方面受到了廣泛關(guān)注.另外，與應(yīng)用普遍的胎牛血清（FBS）相比，使用同一份臍帶血中的自體血清不僅可以為細(xì)胞提供更好的營養(yǎng)物質(zhì)，而且在收獲細(xì)胞后的臨床應(yīng)用中，也可以避免胎牛血清等動物血清引起的免疫反應(yīng).

本研究使用同一份臍帶血的血清，不添加細(xì)胞因子，也無基質(zhì)細(xì)胞支持，采用微載體技術(shù)，實(shí)現(xiàn)臍帶血來源造血干細(xì)胞（UCB－HSCs）與間充質(zhì)干細(xì)胞（UCB－MSCs）的共培養(yǎng)，并實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)后兩種細(xì)胞的分離.繼而考察人自體血清在不同含量（2.8%、5.6%、8.3%和11.1%）下對 UCB－HSCs和UCB－MSCs體外擴(kuò)增的影響，同時將5%、10%、15%和20%的FBS作為參照，來確定血清的較優(yōu)用量.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

IMDM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco；臍血源血清和PBS緩沖鹽溶液自配；人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll－Paque）購自瑞典Amersham Biosciences公司；DMEM （高糖）、地塞米松（Dexamethasone）、IBMX、β－甘油磷酸鈉、吲哚美辛、胰島素、維生素C、運(yùn)鐵蛋白和亞油酸均購自美國Sigma；青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自大連美羅大藥廠；CCK－8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；FITC－抗人CD34、IL－3和 GM－CSF購自美國BD Biosciences公司.

1.2 UCB－MNCs的分離

人臍帶血采自大連市沙河口區(qū)婦幼保健院，使用前已經(jīng)得到產(chǎn)婦及家人知情同意.臍帶血均取自健康產(chǎn)婦足月分娩或足月剖宮產(chǎn)的嬰兒，每次采集量為50～100mL.在15mL無菌離心管內(nèi)加入密度為1.077g·mL－1的人淋巴細(xì)胞分離液4mL，用吸管輕輕地將臍帶血稀釋液（臍帶血與PBS緩沖鹽溶液按體積比1∶1混合稀釋）滴加到人淋巴細(xì)胞分離液液面上（人淋巴細(xì)胞分離液與臍帶血稀釋液的比例為1∶（1～2）），以2 500r/min離心25min.待離心結(jié)束，用吸管將中間白膜層吸取，獲得 UCB－MNCs（單個核細(xì)胞）.分離后的細(xì)胞用IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心洗滌兩次（1 000r/min，5min），調(diào)整細(xì)胞密度備用.

1.3 臍血源血清的提取

臍血源血清的提取方法：將全血室溫下靜置1～2h后，離心（1 000r/min，15min），離心后上清即為血清，取上清于－20℃保存?zhèn)溆?這種方法的弊端是需要將臍帶血分成兩份，來分別提取血清和單個核細(xì)胞，而每份臍帶血50～100mL，所含單個核細(xì)胞為1×108cell左右，如果將其分成兩份一定會減少原代獲取的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果在一定程度上造成了寶貴的干細(xì)胞資源的浪費(fèi).有的學(xué)者[7]采用以下方法同時獲得了血清和單個核細(xì)胞：將離心取完血清后的沉淀物與培養(yǎng)基混合，然后使用甲基纖維素沉淀紅細(xì)胞，接著去上清離心再與淋巴細(xì)胞分離液混合，采用密度梯度離心獲取單個核細(xì)胞.采用這種方法，血清和單個核細(xì)胞雖然能同時獲得，但是過程中需要多次離心，并且從取得臍帶血到分離出單個核細(xì)胞的過程耗時過長，這些都會對原代細(xì)胞的質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響.

1.4 cytodex－3微載體的預(yù)處理

稱取100mg（干質(zhì)量）cytodex－3微載體分別置于兩支15mL無菌離心管中，然后加入10mL新鮮的不含Ca2＋、Mg2＋的PBS緩沖鹽溶液，于37℃環(huán)境中孵育過夜.隔天棄去上清，用新鮮的PBS緩沖鹽溶液（不含Ca2＋、Mg2＋離子）沖洗兩次，再加入10mL PBS緩沖鹽溶液，于115℃、1×105Pa下高壓滅菌15min.滅菌后，在超凈臺內(nèi)操作，先吸去上清，用IMDM培養(yǎng)基清洗兩次，隨后加入10mL IMDM培養(yǎng)基，置于4℃冰箱中備用.

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（即血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）計(jì)數(shù)接種前后細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞密度.

1.6 靜態(tài)培養(yǎng)

共采集7份臍帶血，分別提取人自體血清和單個核細(xì)胞，前6份接種培養(yǎng)條件如下.人自體血清培養(yǎng)：將從新鮮的臍帶血分離得到的UCBMNCs以2×106cells·mL－1的密度接種到24孔板（已提前鋪滿cytodex－3微載體）中，添加20%的同一份臍帶血來源的血清，于37℃、5%CO2、20%O2及飽和濕度條件下共培養(yǎng)12d.通過光鏡觀察，每隔24h計(jì)數(shù).另將胎牛血清培養(yǎng)作為對照組，培養(yǎng)方法為將自臍帶血分離得到的UCB－MNCs按上述相同條件接種，在IMDM培養(yǎng)基中添加20%的FBS，作為對照組.

第7份接種方法如下：將自臍帶血分離得到的MNCs以2×106cells·mL－1的密度接種到已預(yù)先鋪滿cytodex－3微載體的96孔板中.實(shí)驗(yàn)分8組進(jìn)行，人自體血清（HAS）含量依次為5%、10%、15%和20%，F(xiàn)BS含量分別為5%、10%、15%和20%.每組均用10個孔，每孔100μL.每組實(shí)驗(yàn)有3個平行組.每天取各組1個孔內(nèi)的微載體，使用CCK－8試劑盒測定各微載體上細(xì)胞的活力值，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定該孔內(nèi)細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度.隔天為每孔補(bǔ)充10μL相應(yīng)的培養(yǎng)基.取第3、6d的細(xì)胞懸液做CD34＋細(xì)胞流式檢測，并取第6d的微載體，來誘導(dǎo)分化成骨及成脂.

因?yàn)楸狙芯刻崛〉耐环菽殠а难迨遣捎妹芏忍荻入x心后獲得的上層血清，而事先加入的PBS、抗凝劑等已將此血清成分稀釋，所以人自體血清的含量實(shí)際要偏低.通過換算得出培養(yǎng)基中的人自體血清的實(shí)際含量依次為2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.

1.7 CD34＋細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析

對擴(kuò)增前后的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）進(jìn)行CD34－FITC抗體檢測，分別檢測原代、第3d、第6d的CD34＋細(xì)胞含量.細(xì)胞標(biāo)記方法如下：首先用PBS緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞1次，然后加入10mL的CD34－FITC抗體，于4℃下避光孵育30min.孵育結(jié)束后再用PBS緩沖鹽溶液洗滌1次，通過流式細(xì)胞儀分析CD34＋細(xì)胞的含量，用Mac OS 8.6軟件得出檢測結(jié)果.

1.8 CCK－8試劑盒測定細(xì)胞活性

選用CCK－8細(xì)胞活性試劑盒測定微載體上的UCB－MSCs細(xì)胞活性.每天小心吸出96孔板中對應(yīng)孔的細(xì)胞懸液，用PBS緩沖鹽溶液沖洗孔底微載體，然后輕輕吹打，等到微載體沉降到孔板底部后，用移液器小心將上清吸出.如此重復(fù)2～3次后，加入100μL新鮮的IMDM培養(yǎng)基，再加入10μL CCK－8試劑，于37℃下孵育3h，吸出上清，用酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD）.

1.9 UCB－MSCs的多向誘導(dǎo)分化

將已培養(yǎng)6d的UCB－MSCs進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化檢測.其方法如下：小心將原培養(yǎng)基吸出，保留原孔內(nèi)的微載體，用PBS緩沖鹽溶液沖洗1遍，等到微載體沉降后小心將PBS吸出，分別加入成骨和成脂誘導(dǎo)劑.在此過程中，每隔3d全量換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)2周.在第1周進(jìn)行成骨細(xì)胞的ALP染色，第2周進(jìn)行脂肪細(xì)胞的油紅染色，第3周進(jìn)行成骨細(xì)胞的von Kossa染色.成骨誘導(dǎo)劑：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋50μmol·L－1維生素C＋10mmol·L－1β－甘油磷酸鈉.軟骨誘導(dǎo)劑：IMDM＋0.1μmol·L－1地塞米松＋50μg·mL－1維生素C＋100μg·mL－1丙 酮 酸 鈉 ＋10ng· mL－1TFG－β3＋500 ng·mL－1BMP－6＋50mg·mL－1ITS.成脂誘導(dǎo)劑：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋200μmol·L－1吲哚美辛＋0.5mmol·L－1IBMX＋10μg·mL－1胰島素.成骨誘導(dǎo)ALP染色和von Kossa染色方法參見文獻(xiàn)[8，9].

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均選3次平行組，其中統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用t－檢驗(yàn)來確定顯著性水平，用Origin7.5軟件進(jìn)行處理.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 原代UCB－MSCs的培養(yǎng)成功率

本研究共采集了7份臍帶血，其中有5份人自體血清培養(yǎng)組成功培養(yǎng)出UCB－MSCs，成功率約為71.4%.胎牛血清培養(yǎng)組中也有相同的5份成功培養(yǎng)出UCB－MSCs.而另兩份均未培養(yǎng)出UCB－MSCs，原因可能是其中一份臍帶血是過夜（24h）后操作的，細(xì)胞質(zhì)量可能因此受到了一定的影響.

通過考察細(xì)胞在微載體上的貼附及生長狀態(tài)可以看出，同一份臍帶血來源的人自體血清（HAS），對 UCB－HSCs和 UCB－MSCs的體外擴(kuò)增有很好的支持效果，由圖1（a）可以看出 UCBMSCs在cytodex－3微載體上的貼附生長狀態(tài)良好.

與20%FBS的培養(yǎng)效果（圖1（b））相比較，同一份臍帶血來源的人自體血清可以達(dá)到與之相同的培養(yǎng)效果.這說明11.1%含量的臍帶血人自體血清可以替代20%的FBS，在培養(yǎng)過程中支持UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附、伸展和生長.

在培養(yǎng)前6份臍帶血干細(xì)胞的過程中，采用計(jì)數(shù)板每24h統(tǒng)計(jì)懸液中的有核細(xì)胞（NCs）數(shù)，其密度變化如圖1（c）所示.由圖可以看出含量為11.1%HAS培養(yǎng)組和20%FBS培養(yǎng)組的密度變化情況基本是一致的，且11.1%HAS在120h時達(dá)到密度的最大值4.5×106cells·mL－1，而20%FBS在72h達(dá)到最大值3.5×106cells·mL－1，達(dá)到最大值后進(jìn)入平臺期48h.二者無顯著性差異（p＜0.05）.

2.2 原代UCB－HSCs的CD34＋流式結(jié)果

原代細(xì)胞的CD34＋流式結(jié)果如圖2所示.其中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果為加入CD34抗體的檢測結(jié)果，得出陽性率為1.1%；而空白對照組的結(jié)果為未加CD34抗體處理的檢測結(jié)果，得出陽性率為0.4%.兩圖陽性率之差即為原代細(xì)胞中的CD34＋細(xì)胞（UCB－HSCs）含量，約為0.7%.每份臍帶血原代共分離得到單個核細(xì)胞5.28×107cells，其中UCB－HSCs的含量為3.7×105cells.

2.3 UCB－MSCs在微載體上的貼附

培養(yǎng)10d后，在cytodex－3微載體上的UCBMSCs貼附形態(tài)如圖3所示.其中圖3（a）～3（d）為人自體血清培養(yǎng)組，血清含量逐漸遞增，分別為2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.圖3（e）～（h）為作為對照的胎牛血清培養(yǎng)組，血清含量分別為5%、10%、15%和20%.從圖中可以看出，在8組實(shí)驗(yàn)組中均有間充質(zhì)樣細(xì)胞在cytodex－3微載體表面貼附，且伸展?fàn)顟B(tài)良好.但在這8組中，微載體表面的細(xì)胞數(shù)量均略有不同，在HAS及FBS培養(yǎng)組中，隨著血清含量的增加，微載體表面的細(xì)胞數(shù)量都略有增加.

2.4 總有核細(xì)胞（NCs）的擴(kuò)增

在培養(yǎng)條件為加入不同含量血清，同時隔天補(bǔ)液10μL的情況下，96孔板內(nèi)懸液中的細(xì)胞密度變化如圖4（a）、（b）所示.從圖4（a）可以看出，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加HAS時，4組血清濃度不同時，對細(xì)胞密度變化帶來的影響并不大，只是隨著血清濃度的增加，細(xì)胞密度略有增加.各組細(xì)胞密度均在第4d達(dá)到最大值，分別為（2.9±0.1）×106、（3.2±0.25）×106、（3.5±0.4）×106和（3.9±0.1）×106cells·mL－1.由圖4（c）可以看出在培養(yǎng)的第4d，2.8%組 NCs擴(kuò)增了（1.45±0.05）倍，5.6%組 NCs擴(kuò)增了（1.58±0.13）倍，8.3%組 NCs擴(kuò)增了（1.73±0.2）倍，11.1%組 NCs擴(kuò)增了（1.95±0.05）倍.

圖1 含血清培養(yǎng)體系中UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附和NCs細(xì)胞密度變化情況Fig.1 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers and change of density of NCs cultured with serum

圖2 原代UCB－HSCs的流式分析結(jié)果Fig.2 Flow cytometric analysis of primary UCB derived HSCs

圖3 UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附形態(tài)Fig.3 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers

圖4 不同血清條件下的NCs細(xì)胞密度變化和擴(kuò)增倍數(shù)Fig.4 Density change of NCs and expansion fold of NCs cultured with different serum content

從圖4（b）中可以看出，在培養(yǎng)基中加入FBS時，其含量對于NCs的密度變化影響也不是很大，4組同樣均在第4d達(dá)到細(xì)胞密度最大值，依次為（3.6±0.53）×106、（4.0±0.25）×106、（3.7±0.17）×106和（3.97±0.2）×106cells·mL－1.但與 HAS組不同的是，細(xì)胞密度在FBS的含量為10%時最大，培養(yǎng)效果最好.由圖4（d）可以看出培養(yǎng)至第4d時，5%組NCs擴(kuò)增了（1.8±0.26）倍，10%組 NCs擴(kuò)增了（2.0±0.13）倍，15%組 NCs擴(kuò)增了（1.85±0.08）倍，20%組NCs擴(kuò)增了（1.98±0.1）倍.

比較兩種血清培養(yǎng)組中效果最好的細(xì)胞密度變化，也就是將11.1%HAS組和10%FBS組作對比，如圖5所示.可以看出10%FBS的細(xì)胞密度略高于11.1%HAS的，但兩者并無顯著性差異（p＜0.05）.

圖5 NCs的細(xì)胞密度變化曲線Fig.5 Change of the cell density of NCs

2.5 UCB－HSCs（CD34＋）的擴(kuò)增

通過對原代、第3d及第6d細(xì)胞懸液中的有核細(xì)胞進(jìn)行CD34＋細(xì)胞（HSCs）的流式分析，即可獲得血清在不同含量下的CD34＋細(xì)胞（HSCs）的擴(kuò)增結(jié)果，如圖6所示.從圖6（a）中可以看出，HAS含量為5.6%時，對UCB－HSCs的擴(kuò)增是最優(yōu)的，且隨著培養(yǎng)時間的延長，CD34＋細(xì)胞（HSCs）的含量逐漸上升，最大擴(kuò)增倍數(shù)為（1.88±0.33）倍.相比原代培養(yǎng)，其他組的CD34＋細(xì)胞（HSCs）的含量有所下降.從圖6（b）中可以看出，在FBS含量為10%時，培養(yǎng)效果最佳.但是，與HAS培養(yǎng)組不同的是，隨著培養(yǎng)時間的延長，此組的CD34＋細(xì)胞（HSCs）的含量先增加后下降，最大擴(kuò)增倍數(shù)為（4.48±0.9）倍.

同樣比較了5.6%HAS和10%FBS培養(yǎng)下的CD34＋細(xì)胞（HSCs）擴(kuò)增倍數(shù)，如圖6（c）所示.由圖可以看出相比5.6%HAS，在10%FBS時的培養(yǎng)效果更好.

2.6 微載體上UCB－MSCs活性分析

在血清含量不同的培養(yǎng)條件下微載體貼附UCB－MSCs的活性變化如圖7所示.圖7（a）、（b）添加的血清分別為人自體血清和胎牛血清.從圖7（a）可以看出，采用人自體血清培養(yǎng)時，各組的OD相差不大，11.1%組的OD比其他組的略高，但沒有顯著性差異（p＜0.05）.其中當(dāng)HAS含量為11.1%且培養(yǎng)至第3d時OD最大，為0.56±0.07，當(dāng)HAS含量為8.3%時，第7dOD最大，其余兩組在第4d達(dá)到最大值.從圖7（b）中可看出，用FBS培養(yǎng)的各組的OD相差也不大，20%含量的FBS培養(yǎng)組的值要略高于其他組，但也無顯著性差異（p＜0.05）.對于FBS培養(yǎng)組，隨著培養(yǎng)時間的延長，第4d達(dá)到最大值0.5±0.01.而其余3組培養(yǎng)都在第7d達(dá)到最大值，分別為0.48±0.04（5%）、0.53±0.07（15%）和0.6±0.1（20%）.

11.1%HAS與20%FBS組的OD變化情況比較如圖8所示.由圖可看出相比HAS組，F(xiàn)BS培養(yǎng)組的OD略高.將兩組OD的最大值進(jìn)行t－檢驗(yàn)，二者無顯著性差異（p＜0.05），如圖8（b）所示.

圖6 不同血清含量下的UCB－HSCs（CD34＋）的擴(kuò)增情況Fig.6 Expansions of UCB derived HSCs（CD34＋）cultured with different serum content

圖7 不同血清含量培養(yǎng)條件下微載體上UCB－MSCs的活性變化情況Fig.7 ODof UCB－MSCs adhered to microcarrier cultured with different ontent serum

圖8 微載體上UCB－MSCs的OD比較Fig.8 Comparison of ODof UCB－MSCs adheredto microcarrier

2.7 貼附在cytodex－3微載體上細(xì)胞的多向分化潛能分析

UCB－MSCs應(yīng)該具有向成骨、軟骨及脂肪細(xì)胞等多向分化的潛能，其中向軟骨方向的誘導(dǎo)需要大量間充質(zhì)樣細(xì)胞.因?yàn)楸狙芯孔阅殠а蛛x得到的是原代UCB－MSCs，具有較少的細(xì)胞數(shù)量，所以沒有充足數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行向軟骨方向誘導(dǎo)的研究.比較所有培養(yǎng)組中貼附于微載體的細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間的誘導(dǎo)分化無顯著性差異.

當(dāng)成骨誘導(dǎo)1周時，進(jìn)行了ALP染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)有黑褐色顆粒出現(xiàn)，培養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果如圖9所示，這表明微載體上有細(xì)胞表達(dá)ALP.脂肪誘導(dǎo)2周時，進(jìn)行了油紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色后各培養(yǎng)組中均未觀察到油滴的出現(xiàn).對于UCB－MSCs是否有分化成脂肪細(xì)胞的能力說法不一，Kern等[10]作了相關(guān)方面研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCB－MSCs不能轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞.其將骨髓、臍帶血及脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、軟骨及脂肪等方向的分化潛能作了比較，實(shí)驗(yàn)中11份臍血源間充質(zhì)干細(xì)胞均未能表現(xiàn)出向脂肪方向的分化潛能.Kern等認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞能力與干細(xì)胞的老化程度有一定關(guān)系，脂肪細(xì)胞一般是存在于成人的骨髓和脂肪組織中的，在胎兒的骨髓中未能發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞.而Moerman等[11]研究發(fā)現(xiàn)隨著間充質(zhì)干細(xì)胞的老化，其分化成成骨細(xì)胞的能力減弱而分化成脂肪細(xì)胞的能力增強(qiáng).另外，Chang等[12]同樣認(rèn)為 UCB－MSCs向脂肪方向的分化并不敏感.綜上可以得出，相比BM－MSCs等成體來源的干細(xì)胞，UCB－MSCs更為原始、更為早期，其向脂肪細(xì)胞分化的可能性也相對降低.

當(dāng)成骨誘導(dǎo)3周時，進(jìn)行了von Kossa礦化結(jié)節(jié)染色，觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)有鈣化基質(zhì)形成，同時被AgNO3染成了黑色，如圖10所示.由于原代UCB－MSCs含量相對較少，發(fā)現(xiàn)微載體上黑色不是很明顯，但同樣可以確定為鈣化基質(zhì).

圖9 UCB－MSCs向成骨細(xì)胞分化的ALP染色Fig.9 ALP staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

圖10 UCB－MSCs向成骨分化的von Kossa染色Fig.10 von Kossa staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

3 討 論

本研究采用同一份臍帶血來源的血清替代傳統(tǒng)的胎牛血清，進(jìn)行了UCB－MSCs和UCB－HSCs的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果從7份臍帶血中成功培養(yǎng)出5份 UCB－MSCs，UCB－MSCs在cytodex－3微載體表面呈長梭樣貼附，原代培養(yǎng)成功率達(dá)到71.4%，這與張勇剛[13]等的研究結(jié)果（71.2%）相近.

在96孔板的培養(yǎng)組中，考察了兩種類型血清（人自體血清和胎牛血清）及其不同含量對原代UCB－MSCs在cytodex－3微載體表面貼附及生長情況的影響，同時用流式檢測及細(xì)胞計(jì)數(shù)考察了同一體系下UCB－HSCs的擴(kuò)增情況.結(jié)果表明，在96孔板培養(yǎng)體系中只添加血清的情況下，采用微載體技術(shù)可同時培養(yǎng)并收獲同一份臍帶血來源的UCB－HSCs和USB－MSCs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明傳統(tǒng)的FBS可被從同一份臍帶血中提取的HAS所代替，且低含量的HAS培養(yǎng)基可以達(dá)到高含量的FBS培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果.分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，不同含量的血清對總有核細(xì)胞（NCs）的擴(kuò)增倍數(shù)影響不是太大.另外，研究發(fā)現(xiàn)在 HAS組中11.1%的NCs擴(kuò)增效果最好，在對照組FBS中10%含量的NCs擴(kuò)增效果最好，但這兩組間并無顯著性差異（p＜0.05）.由流式檢測得出，5.6%HAS對 UCB－HSCs的擴(kuò)增效果最好，而10%FBS對UCB－HSCs的擴(kuò)增最優(yōu).從CCK－8檢測結(jié)果可以看出，貼附在微載體上的UCB－MSCs的擴(kuò)增效果雖然都是隨著兩種血清含量的增加而略有提高，但各組間并沒有顯著性的差異，也就是說血清含量的影響并不是很大.所以，本文得出對于一次原代實(shí)驗(yàn)中同時培養(yǎng)UCB－HSCs和UCBMSCs而言，HAS的用量為5.6%時效果最佳.

對于所有的培養(yǎng)體系，從懸液中的總有核細(xì)胞（NCs）密度變化的情況可以看出NCs的擴(kuò)增效果并不佳，經(jīng)過4d的培養(yǎng)，11.1%HAS組的NCs僅擴(kuò)增了（1.95±0.05）倍，而10%FBS組則擴(kuò)增了（2.0±0.13）倍.可能的原因如下：① 細(xì)胞接種密度高：由于自臍帶血分離獲得的UCBMSCs的量較少，一般為（0.05～2.8）個/106單個核細(xì)胞[14].由于采用高密度接種有利于原代UCB－MSCs在微載體表面貼附及成功培養(yǎng)，本研究接種的細(xì)胞密度為2×106cells·mL－1.在此密度下，細(xì)胞已經(jīng)很難擴(kuò)增.先前的學(xué)者在造血干細(xì)胞的擴(kuò)增中采用稀釋換液，一般設(shè)定細(xì)胞的上限接種密度為1.5×106cells·mL－1[15].所以，只能采用相對較高的NCs接種密度才能在原代培養(yǎng)中同時獲得UCB－MSCs和UCB－HSCs，則兩種細(xì)胞在原代便難以獲得好的擴(kuò)增效果.但在以后的傳代培養(yǎng)中可采用較低的接種密度及添加細(xì)胞生長因子等來獲得高的擴(kuò)增倍數(shù).② 培養(yǎng)體系?。捍舜窝芯坑玫氖?6孔板的靜態(tài)培養(yǎng)體系，只有100μL，容量過小，這同樣是細(xì)胞擴(kuò)增效果不佳的影響因素之一.另外，靜態(tài)培養(yǎng)中營養(yǎng)物質(zhì)分布不均、代謝產(chǎn)物無法及時排出等其他缺點(diǎn)也同樣制約著培養(yǎng)效果.

盡管本研究中UCB－HSCs和NCs的同時擴(kuò)增效果并不理想，很多方面工作也需進(jìn)一步優(yōu)化，但由實(shí)驗(yàn)可得出，采用同一份臍帶血來源的血清對UCB－HSCs和UCB－MSCs的體外擴(kuò)增有很好的支持作用，這樣為干細(xì)胞在臨床上使用的安全性提供了保障.在今后的研究中可考慮采用三維動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，如轉(zhuǎn)瓶或旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器等，因?yàn)閯討B(tài)反應(yīng)器不僅可以提供較大的培養(yǎng)空間來提高細(xì)胞的擴(kuò)增能力，而且還可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的供給更加充分，由此提高細(xì)胞的擴(kuò)增能力.

4 結(jié) 論

離心后得到的臍帶血來源的人自體血清可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胎牛血清，可支持 UCB－HSCs和UCB－MSCs的體外培養(yǎng)，為這兩種細(xì)胞提供營養(yǎng)成分.此外，HAS使得UCB－MSCs的原代培養(yǎng)成功率達(dá)到71.4%，同時支持其在微載體cytodex－3上的貼附、伸展與生長等特性.在只添加血清的96孔板培養(yǎng)體系中結(jié)合微載體技術(shù)可同時培養(yǎng)并收獲同一份臍帶血來源的UCB－HSCs和USBMSCs，且對于一次原代實(shí)驗(yàn)中同時培養(yǎng)UCBHSCs和 UCB－MSCs而言，HAS的用量約為5.6%時效果最佳.

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