白芍總苷對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜β抑制蛋白的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖的關(guān)系

吳華勛，陳鏡宇，汪慶童，孫嫵弋，常 艷，吳育晶，張玲玲，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230032)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病［1］。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從白芍干燥根中提取的有效部位，研究表明［2－3］，TGP可以抑制關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)免疫功能，在臨床上治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎已經(jīng)發(fā)揮了重要作用。滑膜炎的核心問(wèn)題之一是滑膜細(xì)胞異常增殖，盡管對(duì)其的原因研究較多，涉及到多個(gè)細(xì)胞因子的作用以及 NF-κB、MAPKs信號(hào)的參與等，但G蛋白偶聯(lián)信號(hào)在其中的作用較明顯。研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白-AC-cAMP信號(hào)通路介導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞的異常增殖，TGP能明顯抑制實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中Gi的表達(dá)，促進(jìn)Gs的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而降低滑膜細(xì)胞的增殖與分泌［4－6］。

G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的膜蛋白家族，是重要的藥物作用靶點(diǎn)，在炎癥免疫應(yīng)答中起著重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［7］。β抑制蛋白分為β抑制蛋白1、2兩種亞型，廣泛存在于各種細(xì)胞中，調(diào)節(jié)絕大多數(shù)GPCRs的活性，促進(jìn)GPCRs內(nèi)化和脫敏［8］。其中β抑制蛋白1在胞質(zhì)和胞核中都有表達(dá)，除參與GPCRs的調(diào)節(jié)，還可能通過(guò)核內(nèi)功能調(diào)節(jié)自身免疫病;而β抑制蛋白2僅在胞質(zhì)中表達(dá)，還參與了腫瘤壞死因子受體、TLR/IL-1R/RANK等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10］，在膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜組織中β抑制蛋白2表達(dá)在致炎后d 21、d 28明顯增加，d 28達(dá)到峰值，與病程發(fā)展有相關(guān)性，可能與其影響G蛋白-cAMP信號(hào)通路發(fā)生異常改變有關(guān)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，采用β抑制蛋白2基因敲除小鼠，誘導(dǎo)造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β抑制蛋白2基因敲除小鼠影響了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，這與其對(duì)滑膜細(xì)胞炎癥的調(diào)整有關(guān)［11］。TGP對(duì)滑膜β抑制蛋白表達(dá)的影響是否與其抑制滑膜細(xì)胞增殖作用相關(guān)，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文主要探討TGP對(duì)CIA大鼠滑膜β抑制蛋白1、2表達(dá)的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖的關(guān)系，旨在進(jìn)一步揭示TGP治療作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(120±20)g，♂，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。

1.2藥物與試劑TGP:棕色粉末，由亳白芍干燥根提取、純化后得到;由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所化學(xué)室提供，給藥時(shí)以質(zhì)量濃度5 g·L－1羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度;雷公藤多苷(GTW)，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)均以質(zhì)量濃度5 g·L－1羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度;卡介苗(BCG):衛(wèi)生部上海生物制品所產(chǎn)品，用前80℃滅活;雞Ⅱ型膠原(CCⅡ):上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所;羊抗β抑制蛋白1抗體(K16，sc-9182):購(gòu)于Santa Cruz公司;小鼠抗 β抑制蛋白2抗體 (H-9，sc-13140):購(gòu)于Santa Cruz公司;辣根酶兔抗山羊IgG(H+L)，辣根酶山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)于北京中杉公司;β-actin選購(gòu)于Sigma公司;

1.3方法

1.3.1大鼠CIA模型的建立將 CCⅡ溶于0.1 mol·L－1的冰醋酸中，濃度為 0.4 g·L－1，將研缽置于冰袋上，研磨CCⅡ至充分溶解，置4℃冰箱過(guò)夜;再將80℃、1 h滅活的BCG溶于液體石蠟中，配成0.4 g·L－1的完全弗氏佐劑(CFA)，將二者等體積混合、乳化，制成CCⅡ乳劑(即每1 ml中含0.2 mg CCII)。將該乳劑于大鼠的足爪、背部、尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射致炎(1 ml/只)。注射致炎后d 7，再用上述CⅡ乳劑背、尾部皮內(nèi)注射加強(qiáng)(1 ml/只)。正常組用生理鹽水同法注射。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案SD大鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組，CIA模型組，TGP低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg－1)和陽(yáng)性對(duì)照組(GTW 40 mg·kg－1)。各用藥組于致炎后d 14～28 ig給藥，qd，正常對(duì)照組和CIA模型組ig等容量的5 g·L－1羧甲基纖維素鈉。

1.3.3關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評(píng)分致炎后d 14、d 20、d 28觀察并記錄大鼠全身關(guān)節(jié)病變情況，每只足趾按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:0分:正常;1分:踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;2分:踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和中度腫脹;4分:踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。未注射膠原的其余3個(gè)關(guān)節(jié)的評(píng)分累計(jì)之和即為每只大鼠的AI。

1.3.4滑膜細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定采用MTT法。體內(nèi)給藥各組大鼠滑膜細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，制備細(xì)胞懸液(5 ×109cells·L－1)，加至96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，再加入 100 μl含 8 mg·L－1LPS 的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)72h，終止培養(yǎng)前4 h各孔加MTT(5 g·L－1)溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，加入DMSO(100 μl/孔)，振蕩3 min后于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(absorbance，A值)。以正常大鼠滑膜細(xì)胞為對(duì)照組，每組以6孔的均值表示其結(jié)果。

1.3.5β抑制蛋白表達(dá)的測(cè)定處死大鼠，取滑膜組織，提取蛋白行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用質(zhì)量濃度50 g·L－1脫脂牛奶室溫封閉2 h;室溫孵育一抗2 h，PBS洗3次，每次10min;室溫孵育二抗2 h，PBS洗3次，每次10 min;ECL試劑盒顯色。結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)掃描后，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達(dá)水平。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0軟件處理，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1TGP對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎足爪指數(shù)評(píng)分的影響致炎后d14，對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)分，CIA模型大鼠足爪分值不斷升高，到d 28達(dá)高峰，與足爪腫脹時(shí)間一致。TGP(25、50、100 mg·kg－1，d 14 ～28)、GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)連續(xù)灌胃給藥14 d，可明顯抑制CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評(píng)分分值(Tab 1)。

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA group

Group Dose/mg·kg－1 Arthritis index d 20 d 24 d 28 CIA － 3.667 ±1.231 5.678 ±1.435 7.000 ±1.279 TGP 25 2.454 ±1.086* 3.300 ±1.712＊＊ 2.636 ±1.054＊＊50 2.300 ±0.948＊＊ 3.181 ±1.250＊＊ 2.600 ±1.776＊＊100 2.100 ±0.934＊＊ 2.600 ±1.577＊＊ 2.012 ±0.911＊＊GTW 40 2.500 ±1.080* 2.610 ±1.567＊＊ 2.512 ±1.269＊＊

2.2TGP體內(nèi)用藥對(duì)CIA大鼠FLS增殖反應(yīng)的影響末次給藥后分離大鼠滑膜組織，經(jīng)膠原酶－胰蛋白酶消化法分離得到FLS，取第3代FLS，MTT法檢測(cè)其增殖反應(yīng)。結(jié)果表明，CIA大鼠FLS增殖反應(yīng)增強(qiáng)，TGP(50、100 mg·kg－1，d 14 ～ 28)和GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)可不同程度的抑制FLS增殖反應(yīng)(Tab 2)。

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

#P＜0.05 vs normal;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA.

Group Dose/mg·kg－1 Synoviocyte proliferation(A)Normal － 0.110 ±0.020 CIA － 0.163 ±0.037#TGP 25 0.136 ±0.034 50 0.116 ±0.023*100 0.107 ±0.017＊＊GTW 40 0.112 ±0.020*

2.3TGP體內(nèi)用藥對(duì)滑膜組織β抑制蛋白表達(dá)的影響大鼠致炎后d 28處死，分離滑膜組織，用Western blot法檢測(cè)滑膜組織中β抑制蛋白1、2表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常組相比，模型組β抑制蛋白2表達(dá)明顯升高，β抑制蛋白1無(wú)明顯變化;TGP(100 mg·kg－1)能明顯減少致炎后β抑制蛋白2的表達(dá)，而對(duì)β抑制蛋白1表達(dá)無(wú)明顯影響(Fig 1)。

Fig 1 Effects of TGP on expression of β-arrestins in synovial tissue of CIA rats(±s，n=4)

2.4TGP對(duì)CIA大鼠滑膜β抑制蛋白表達(dá)的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖作用相關(guān)性分析TGP對(duì)β抑制蛋白1表達(dá)無(wú)影響，故主要分析TGP對(duì)CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達(dá)的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖作用的相關(guān)性。經(jīng)相關(guān)性分析，TGP對(duì)CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達(dá)的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖作用呈高度相關(guān)(r=0.88)，隨著TGP濃度的增加，其下調(diào)β抑制蛋白2表達(dá)的作用增強(qiáng)，抑制滑膜細(xì)胞增殖作用增加，逐漸趨于正常組的β抑制蛋白2表達(dá)水平及滑膜細(xì)胞增殖狀態(tài)(Fig 2)。

3 討論

G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常在炎癥免疫性疾病進(jìn)程中起重要作用［12］，其中GPCRs－G蛋白－cAMP信號(hào)通路參與多種生理活性的調(diào)節(jié)，包括對(duì)細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。細(xì)胞的異常增殖、快速分化等與細(xì)胞內(nèi)的cAMP改變有關(guān)，cAMP水平增高可抑制細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

Fig 2 Correlation analysis between effects of TGP on expression of β-arrestin 2 and on synoviocyte proliferation(A)

β抑制蛋白是GPCR信號(hào)的負(fù)調(diào)控者，與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptors kinases，GRKs)協(xié)同促進(jìn)GPCRs內(nèi)化和脫敏。β抑制蛋白的功能變化將影響GPCRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)［13］，從而可能影響 cAMP水平及細(xì)胞的增殖活性。另外，β抑制蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié) NF-κB、MAPKs信號(hào)通路參與許多炎癥免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達(dá)升高，TGP對(duì)CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達(dá)的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖作用呈高度相關(guān)。本課題組以往研究也發(fā)現(xiàn)，在CIA大鼠滑膜細(xì)胞中GRKs的表達(dá)在炎癥高峰期上調(diào)，與病程發(fā)展有相關(guān)性［14］。根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推斷關(guān)節(jié)炎癥期間，各種致炎細(xì)胞因子水平升高，長(zhǎng)期或反復(fù)刺激后，可能引起β抑制蛋白2自身保護(hù)性的表達(dá)上調(diào)，以促進(jìn)GPCRs與G蛋白脫偶聯(lián)，從而關(guān)閉了一些通過(guò)GPCRs的信號(hào)通路，導(dǎo)致G蛋白-cAMP信號(hào)通路發(fā)生異常改變，cAMP水平下降。TGP能下調(diào)β抑制蛋白2的表達(dá)，降低其對(duì)GPCRs與G蛋白的脫偶聯(lián)作用，恢復(fù)G蛋白-cAMP信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制滑膜細(xì)胞增殖，治療關(guān)節(jié)炎的作用。

此外，在RA中NF-κB是明顯活化的，它在RA炎癥、骨質(zhì)破壞、細(xì)胞的增殖、血管翳的形成中起重要作用，β抑制蛋白表達(dá)的上調(diào)可以明顯抑制NF-κB活化;MAPKs在RA滑膜組織中表達(dá)升高，β抑制蛋白2可以作為支架蛋白，促進(jìn)MAPKs通路的活化［10］;β抑制蛋白對(duì)這些通路的調(diào)整也可能參與了RA的發(fā)病過(guò)程，在下一步的工作中將進(jìn)一步探討。

［1］Bax M，van Heemst J，Huizinga T，et al.Genetics of rheumatoid ar-thritis:what have we learned［J］?Immunogenetics，2011，63(8):459－66.

［1］朱 蕾，魏 偉.白芍總苷對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎及其免疫功能的影響［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(20):1547 －51.

［2］Zhu L，Wei W.Effects of total glucosides of paeony on immune functions in rats with collagen-induced arthritis［J］.Chin Pharm J，2007，42(20):1547 －51.

［3］Xu H M，Wei W，Jia X Y，et al.Effects and mechanisms of total glucosides of paeony on adjuvant arthritis in rats［J］.Ethnopharmacol，2007，109(3):442 －8.

［4］Chen Q，Wei W.Effects and mechanisms of glucosides of chaenomeles speciosa on collagen-induced arthritis in rats［J］.Int Immunopharmacol，2003，3:593 －608.

［5］Zhang L L，Wei W，Wang N P，et al.Paeoniflorin suppresses inflammatory mediator production and regulates G protein-coupled signaling in fibroblast-like synoviocytes of collagen induced arthritic rats［J］.Inflamm Res，2008，57:388 －95.

［6］常 艷，魏 偉，張 磊，徐紅梅.白芍總苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞功能的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(2):185 －8.

［6］Chang Y，Wei W，Zhang L，Xu H M.Effects of TGP on functions of fibroblast-like synoviocytes under the stimulation of IL-1β in CIA rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(2):185 － 8.

［7］Hutchings C J，Koglin M，Marshall F H.Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors［J］.MAbs，2010，2(6):594－606.

［8］Vibhuti A，Gupta K，Subramanian H，et al.Distinct and shared roles of β-arrestin-1 and β-arrestin-2 on the regulation of C3a receptor signaling in human mast cells［J］.PLoS One，2011，6(5):e19585.

［9］Ma L，Pei G.Beta-arrestin signaling and regulation of transcription［J］.J Cell Sci，2007，120(2):213 －8.

［10］吳華勛，陳鏡宇，嚴(yán)尚學(xué)，等.膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織βarrestin 1和β-arrestin 2的表達(dá)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(2):648－50.

［10］Wu H X，Chen J Y，Yan S X，et al.The expression of beta-arrestin 1 and beta-arrestin 2 in the synovium of collagen-induced arthritis rats［J］.Acta Univ Med Anhui，2008，43(2):648 － 50.

［11］Li P，Cook J A，Gilkeson G S，et al.Increased expression of betaarrestin 1 and 2 in murine models of rheumatoid arthritis:isoform specific regulation of inflammation［J］.Mol Immunol，2011，49(1-2):64－74.

［12］吳 虹，宋禮華，魏 偉.與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體及治療藥物作用靶點(diǎn)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(9):1048－53.

［12］Wu H，Song L H，Wei W.G protein.coupled receptor and drug targets for therapy in rheumatoid arthritis［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(9):1048 －53.

［13］Dromey J R，Pfleger K D.G Protein coupled receptors as drug targets:the role of beta-arrestins［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2008，8(1):51 －61.

［14］陳鏡宇，吳華勛，陳 尹，等.膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織G蛋白偶聯(lián)受體激酶的表達(dá)及白芍總苷對(duì)其的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(6):715 －7.

［14］Chen J Y，Wu H X，Chen Y，et al.Expression of GRKs in synovial tissue from rats with collagen-induced arthritis and the effect of total glucosides of paeony［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):715－7.