HPLC法測定果蔬纖維顆粒中荷葉堿含量

田 垚，王 蓮，李 征，羅 威，張榮泉

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

果蔬纖維顆粒由荷葉、決明子、果蔬纖維、南瓜粉等組方，經(jīng)制粒等工藝制備而成，具有降脂、通便、調(diào)節(jié)血糖和預(yù)防食物攝入過量等作用[1]?！侗静菥V目》記載荷葉能解毒斂瘡，可降脂、清熱、靜心益色、駐顏輕身[2]。荷葉中含有荷葉堿、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、皂苷及甾體等多種化學(xué)成分，其主要活性物質(zhì)荷葉堿是一種阿樸啡型生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為荷葉堿有促進(jìn)脂肪分解，降低血清中甘油三醇和膽固醇含量，及調(diào)節(jié)血脂等作用，還具有利尿通便、通腸毒、清暑解熱等作用[3]。本品以荷葉堿作為有效成分，擬建立果蔬纖維顆粒中荷葉堿的高效液相色譜檢測方法，以保證該產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(日本島津公司)，KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LDZ5-2離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速：5 000 r/min，北京京立離心機(jī)有限公司)；AB204-E型電子天平(萬分之一精度)。

1.2試藥 荷葉堿對照品(四川省維克奇生物科技有限公司提供，批號201009)；果蔬纖維顆粒(天津市醫(yī)藥研究開發(fā)公司)；無水乙醇，三乙胺，冰醋酸均為分析純；乙腈為色譜純，實(shí)驗用水為純化水。

2 方法和結(jié)果

2.1色譜條件[4]色譜柱：依利特Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流動相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(34∶63.6∶1.6∶0.78)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取荷葉堿對照品14.7 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，混勻，即得荷葉堿對照品儲備液A(294 μg /ml)。再精密吸取對照品儲備液A 1.0 ml置25 ml量瓶內(nèi)，用甲醇定容，制成對照品儲備液B(11.76 μg /ml)。 精密吸取對照品儲備液B 3.0 ml置10 ml量瓶內(nèi)，用甲醇定容，制成對照品溶液(3.528 μg /ml)。

2.2.2供試品溶液的制備 取果蔬纖維顆粒供試品適量，研細(xì)，精密稱取約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻。將超聲后的供試品離心處理(2 500 r/min)5 min，精密吸取上層清液20 ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容置5 ml量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 按照果蔬纖維顆粒配方，去除含有荷葉堿成分的荷葉藥材，以輔料補(bǔ)齊重量，相同工藝制成樣品，做為陰性樣品并按“2.2.2”項下制成陰性樣品溶液。

2.3干擾試驗 取對照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測定。結(jié)果顯示供試品溶液色譜圖與對照品溶液色譜圖中的相同位置(約13 min處)，有相同的色譜峰出現(xiàn)，而陰性樣品溶液在此處無峰(圖1)。由此表明處方中其他成分對荷葉堿含量測定無干擾。

2.4線性關(guān)系考查 精密吸取對照品溶液B 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇至刻度。將以上6個濃度的對照品溶液分別注入液相色譜儀中測定，以溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=75 046X+105.21(r=0.999 8)。結(jié)果表明荷葉堿進(jìn)樣濃度在0.588～5.88 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

1.荷葉堿圖1 陰性樣品(A)對照品(B)供試品(C)HPLC色譜圖

2.5精密度試驗 將對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行HPLC測定。測定結(jié)果峰面積值的RSD為0.58%(n=6)。

2.6重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一批供試品6份，依法制備供試品溶液并測定。測定結(jié)果荷葉堿含量的RSD為0.71%(n=6)。

2.7穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8和24 h時進(jìn)樣測定。測定結(jié)果峰面積的RSD為0.83%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收試驗 精密稱取荷葉堿含量為14.482 μg/g的供試品約1.5 g，共9份，分別精密加入稀釋100倍的對照品儲備液A 2.5、5.0、7.5 ml(相當(dāng)荷葉堿7.35、14.70、22.05 μg)各3份，依法提取，再分別注入液相色譜儀中進(jìn)行測定，計算回收率。9份測定結(jié)果平均回收率為98.56%，RSD為1.13%(n=9)，荷葉堿加樣回收試驗結(jié)果見表1。

2.9樣品含量測定 取果蔬纖維顆粒3批產(chǎn)品為供試品(批號分別為20100911、20100925、20101009)，按照擬定的溶液制備方法和高效液相色譜條件測定果蔬纖維顆粒中荷葉堿的含量。3批供試品中荷葉堿含量測定結(jié)果分別為15.580、14.602和15.223 μg/g。

表1 荷葉堿加樣回收試驗結(jié)果

3 討論

3.1測定波長的選擇 荷葉堿對照品溶液，以試劑為空白，用紫外分光光度儀選擇波長，在190～700 nm范圍內(nèi)掃描，荷葉堿在270 nm處有最大吸收，故選擇270 nm波長為荷葉堿測定波長。

3.2供試品荷葉堿提取方法的選擇 在對供試品處理時，考查了以不同濃度的甲醇(50%甲醇、70%甲醇、無水甲醇)做為提取溶劑提取荷葉堿的效果，試驗結(jié)果表明使用50%甲醇提取時，供試品中荷葉堿的提取率較高。提取超聲時間選擇試驗中，分別考查了超聲30、45、60和90 min；測定結(jié)果顯示，供試品在超聲提取60 min后，荷葉堿提取率達(dá)可達(dá)90%以上，與超聲90 min時的荷葉堿含量無顯著性差異，因此可選擇超聲60 min。

3.3果蔬纖維顆粒在制備過程中，因加入了部分原料粉末，配方中黏合劑的使用對超聲提取效果有一定的影響，用常規(guī)方法處理樣品，因過濾困難使回收率受到影響，本試驗中采用了離心方法，在設(shè)定的離心條件下處理樣品，定量吸取上清液，經(jīng)定量轉(zhuǎn)移、濃縮等可獲得滿意結(jié)果。

1 張榮泉，呂方，王蓮.比色法測定果蔬纖維顆粒中總黃酮的含量.食品研究與開發(fā)，2008,29(10)：95

2 孔文琦，李嚴(yán)巍.荷葉活性化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展.中藥研究與信息，2005，7(6)：22

3 朱秀萍，徐翔.荷葉生物堿研究進(jìn)展.中國藥房，2008，19(6)：459

4 柴金玲，李偉，谷學(xué)新.高效液相色譜法測定荷葉中荷葉堿的含量.藥物分析雜志，2005，25(8)：932