HPLC法測定益肺通絡(luò)膠囊中虎杖苷的含量

嚴(yán) 紅 ，高丹丹，胡 君

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

益肺通絡(luò)膠囊由黨參、虎杖、核桃仁、川芎等中藥組成，具有補(bǔ)益肺腎、活血消痰、疏通肺絡(luò)之功效，主治肺腎兩虛、咳嗽氣喘、低氧性肺動脈高壓(COPD)、肺纖維化、肺心病等?；⒄溶?PD)為虎杖中重要的生理活性成分，也稱白藜蘆醇苷[1]，研究表明，PD能抑制心肌收縮、抑制血小板聚集、降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抗慢性常壓低氧性肺動脈高壓[2]，對H/R誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用[3]。為此研究建立益肺通絡(luò)膠囊中虎杖苷含量測定方法 ，本方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可用于益肺通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(LC-10AT VP紫外檢測器，SPD-10A VP高壓輸液泵，N2000數(shù)據(jù)工作站 ，浙江大學(xué)智能信息研究所)；AG-135型電子天平 (十萬分之一，梅特勒-多利托)；TCQ-250型超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)?；⒄溶諏φ掌?中國藥品生物制品檢定所提供，批號111575-200502)；益肺通絡(luò)膠囊(本院制劑室提供，批號100906、101106和101108)；乙腈 (色譜純 )，水 (純化水)，其他試劑均為分析純 (天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Inerter C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動相 ：乙腈-水 (23∶77)[4]；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：306 nm；柱溫：室溫；理論板數(shù)按虎杖苷峰計算不低于3 000。

2.2溶液制備

2．2．1對照品溶液的制備 取虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 ml含15 μg的溶液，即得。

2．2．2供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．2．3陰性對照溶液的制備 按處方取除虎杖的各味藥材，按工藝制得陰性制劑，再按“2．2．2”項下方法制得陰性對照溶液。

2.3專屬性考查 分別精密吸取虎杖苷對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2．1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果陰性對照溶液無干擾，見圖1。

1．虎杖苷圖1 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考查 取虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 ml含虎杖苷0.148 mg的溶液，作為貯備液，再分別精密量取0.5、1、1.5、2和2.5 ml，置10 ml量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述5種濃度的對照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析，以對照品濃度(μg/ml)為縱坐標(biāo)，峰面積值為橫坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=3.06×10-5X(r=0.999 9)。結(jié)果表明在0.148～0.740 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.5精密度試驗 取益肺通絡(luò)膠囊(批號100906)內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，1份，精密稱定，按照“2．2．2”項下方法操作，按“2.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得樣品中虎杖苷峰面積的RSD為0.6%，符合要求。

2．6穩(wěn)定性試驗 取益肺通絡(luò)膠囊(批號100906)內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，1份，精密稱定，按照“2．2．2”項下方法操作，按“2.1”項下色譜條件分析，分別在0、1、2、3、4、5、6、7和8 h測定樣品中虎杖苷峰面積，測得峰面積值的RSD為0.4%，表明供試品溶液在8 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2．7重現(xiàn)性試驗 取益肺通絡(luò)膠囊(100906)內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，共6份，精密稱定，按照“2．2．2”項下方法操作，按“2.1”色譜條件分析，測得樣品中虎杖苷平均含量為1.62 mg/g，RSD為0.7%。

2．8回收率試驗 取同一批號樣品(批號100906)內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.25 g，共6份，精密稱定，分別加入虎杖苷對照品溶液0.148 mg/ml各2.5 ml，加入稀乙醇47.5 ml，再按照“2．2．2”項下方法操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，計算回收率，結(jié)果平均回收率為101.4%，RSD為1.5%。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2．9樣品測定 取益肺通絡(luò)膠囊 (批號 100906、101106、101108)，分別按“2．2．2”項下方法制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果3批益肺通絡(luò)膠囊中的虎杖苷含量分別為1.62、2.90和3.24 mg/g。

3 討論

3.1供試品溶液制備方法 本試驗先后考察不同提取溶劑 (稀乙醇、甲醇和80%甲醇)、不同提取方法(回流、超聲)、不同超聲處理時間 (15、30和45 min)及提取溶劑用量 (25、50和75 ml)對虎杖苷含量測定的影響，最終確定供品溶液制備方法為稀乙醇50 ml，超聲30 min，該條件省時、節(jié)能環(huán)保。

3.2供試品提取和保存方法 《中國藥典》[4]收載的虎杖苷含量測定方法要求避光操作。為此采用無色透明量瓶和棕色量瓶超聲提取樣品，無色透明樣品瓶和棕色樣品瓶存放供試品溶液，含量測定結(jié)果一致，故本方法未做避光規(guī)定。

3.3檢測波長的確定 在190～600 nm進(jìn)行波長掃描，虎杖苷在 306 nm處有最大吸收峰，根據(jù)《中國藥典》2010年版一部虎杖[4]項下，最終確定306 nm為檢測波長。方法學(xué)考察表明，高效液相色譜法測定該制劑中虎杖苷含量，方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可以作為該制劑的質(zhì)控指標(biāo)。

1 高守紅，楊少麟，范國榮.虎杖苷的研究進(jìn)展 .藥學(xué)實踐雜志，2005，23(30)：145

2 陳莉延，梁標(biāo)，金勛杰，等．白藜蘆醇苷對大鼠慢性常壓低氧性肺動脈高壓的防治作用．實用醫(yī)學(xué)雜志，2002，18(8)：807

3 胡語航，王興勇，何素蓉，等．白藜蘆醇苷對缺氧復(fù)氧HK2細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，30(22):2120

4 中國藥典.一部．2010：194