利用3對SSR標(biāo)記鑒定兩優(yōu)287種子純度及對雜株類型的定量分析

郭承亮，耿月明

（湖北省種子集團有限公司，湖北 武漢 430070）

種子純度是種子質(zhì)量的一個核心指標(biāo)，是企業(yè)購銷種子的關(guān)鍵依據(jù)，也是企業(yè)生存之根本。種子純度檢測主要有海南大田種植鑒定（以下簡稱“南鑒”）、大田正季種植鑒定（以下簡稱“正鑒”）以及SSR分子標(biāo)記鑒定等方法。三種方法各有特點：“南鑒”和“正鑒”是以田間種植方式，從植株的典型特異性判別、鑒定種子純度。“南鑒”具有鑒定相對準(zhǔn)確、時間上相對提前的優(yōu)點，但海南冬季屬短日低溫條件，感光類型及兩系不育系表現(xiàn)正常結(jié)實，兩系雜交水稻種子純度鑒定結(jié)果往往失真；“正鑒”具有鑒定準(zhǔn)確、鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)吻合度高的優(yōu)點，但時間明顯滯后，從歷年發(fā)生的重大種子質(zhì)量事件來看，絕大多數(shù)是在得知種子純度不合格之前種子已經(jīng)銷售到千家萬戶無法“召回”，最終釀成無法挽回的損失。SSR分子標(biāo)記是檢測DNA水平上的生物個體差異，由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳共顯性、譜帶擴增穩(wěn)定、精度高、檢測時間短、不受環(huán)境條件影響、實驗操作簡單等特點廣受重視；可以將呈父母本互補帶型的雜交種與其雙親、甚至一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開，因此成為品種鑒定的理想分子標(biāo)記，在雜交水稻種子純度鑒定研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用[1～4]。在目前的實驗操作中，由于受單個標(biāo)記檢測的局限性，不能將一些雜株以及一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開。本研究首先利用24對SSR標(biāo)記對兩優(yōu)287及其大田正季鑒定中的9種雜株類型進行特異性分析，最終篩選出可將雜株類型相對區(qū)分開的3對SSR標(biāo)記，并利用其對正季鑒定中的同一份樣本進行分析，鑒定出的種子純度及所含雜株類型比例與大田正季鑒定中的結(jié)果基本吻合。本研究通過多對標(biāo)記對雜交水稻種子同一份樣本進行純度鑒定以及雜株類型定量分析，系統(tǒng)比較了兩種方法的鑒定結(jié)果，并分析了檢測結(jié)果的差異性原因，為公司兩優(yōu)287種子的銷售提供了質(zhì)量保證。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究包含2個試驗：試驗一中的雜株類型來自正季鑒定中收集的9種雜株類型，試驗二所用樣品為正季鑒定材料中的同一份樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗一：在湖北省種子集團有限公司鄂州基地正季種植并按照當(dāng)?shù)卦耘喙芾矸椒ㄔ耘鄡蓛?yōu)287樣品，調(diào)查雜交稻表型性狀，并統(tǒng)計雜株類型和田間調(diào)查鑒定結(jié)果。取正季鑒定中9種雜株類型與雜交種F1，取其葉片參照CTAB法[5]提取DNA，按照PCR擴增10μL體系：1 μL DNA 模板， 1 μL 10×PCR buffer，0.8 μL 25 mmol的 MgCl2，0.2 μL 的 10 mmol dNTP，0.1 μL 的10 μmol正 向 引物 （primer F），0.1 μL 的 反 向引物（primer R），0.2 μL rTaq 酶 （Takara，5 U/μL），6.6 μL滅菌ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，32～35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，然后72℃延伸7 min。PCR電泳檢測：采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.2 試驗二：取正季鑒定中同一份樣本的1920粒水稻種子，采用簡易法提取DNA[6～9]：剪取0.5 cm長的水稻幼苗（幼葉或幼莖），放入96PCR板的孔中，每孔加入 40μL 0.25 mol/L的 NaOH,在沸水中煮 30 s，然后加入 40μL 0.25 mol/L的 HCl和 20μL 0.5 mol/L的Tris（pH 8.0,含有體積分數(shù)為0.25%的IGEPALCA630）的混合液,在沸水中煮沸 2 min，用1μL進行PCR擴增，其余4℃保存。然后按照試驗一中的方法進行。

2 結(jié)果和分析

2.1 試驗一鑒定結(jié)果

通過田間調(diào)查鑒定了兩優(yōu)287雜交稻材料的純度，選取其中的9種雜株類型，包括不育系9802 s、父本、紫稈紅稃尖、變異株1（比兩優(yōu)287矮）、變異株2（比兩優(yōu)287高）、紫稈遲熟株、遲熟株1（遲熟25天以上）、遲熟株2（遲熟15天左右）、青稞，歸類并統(tǒng)計雜株總數(shù)及所占比例，結(jié)果見表1。

2.2 試驗二純度鑒定及對雜株類型分析結(jié)果

利用24對SSR標(biāo)記對兩優(yōu)287大田正季鑒定中的這9種雜株類型進行差異化分析，最終篩選出3對SSR標(biāo)記RM19、RM71、RM224可以將這9種雜株類型相對區(qū)分開：通過RM71可以鑒別4和5（變異株1和變異株2）以及7（紫稈遲熟株）；通過RM19可以鑒別1（不育系）；通過RM71與RM19同時可以將3和6歸在一起鑒別出來；通過RM71、RM19、RM224可以將2、8、9分別鑒定出來，結(jié)果見表 1。

表1 兩系雜交水稻種子純度大田正季鑒定和三對SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果

2.3 試驗一與試驗二純度鑒定及雜株類型分布結(jié)果比較

通過3對SSR標(biāo)記和田間調(diào)查，鑒定了兩優(yōu)287雜交稻材料的純度并對雜株類型進行定量分析 （見表1），結(jié)果表明，經(jīng)過多對SSR標(biāo)記檢測的純度為96.61%，而田間調(diào)查鑒定結(jié)果為97.10%，分子標(biāo)記檢測和田間調(diào)查鑒定結(jié)果基本吻合，各種雜株類型的分布基本一致，但是通過分子標(biāo)記檢測到0.31%的其它基因型的雜株。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)合大田正季種植鑒定，利用多對SSR標(biāo)記系統(tǒng)分析了兩優(yōu)287純度、各雜株類型相互間的區(qū)別并對樣本進行分析統(tǒng)計。按照需求，選取了其中的3對SSR標(biāo)記，可以將9種雜株類型全部鑒定出來并相對應(yīng)歸類。研究還發(fā)現(xiàn)，利用多對SSR標(biāo)記鑒定的結(jié)果與大田正季鑒定的結(jié)果基本一致，各種雜株類型所占的比例也基本一致。但是通過3對SSR標(biāo)記鑒定分析，還發(fā)現(xiàn)與9種雜株類型的基因型不一致的其他一些基因型雜株，對這些基因型所代表的雜株表現(xiàn)型還有待在正季鑒定中進一步研究。

本次研究對同一份樣本采取兩種鑒定方法鑒定種子純度，產(chǎn)生一定的差異。研究認為，造成多對SSR標(biāo)記鑒定純度偏低的主要原因是：有一些雜株在正季鑒定中不表現(xiàn)出雜株表現(xiàn)型，而SSR標(biāo)記能較明顯的顯示出是雜株，3對SSR標(biāo)記檢測中發(fā)現(xiàn)有0.31%的其它雜株類型的基因型。其次，兩優(yōu)287的父本在大田正季鑒定中也較難以明顯鑒定出來，所以也導(dǎo)致大田正季鑒定的父本所占比例較SSR標(biāo)記鑒定的結(jié)果低0.12%。

本研究是本公司利用自己建立的生物實驗室，結(jié)合企業(yè)所在制種基地的實際生產(chǎn)情況，將兩優(yōu)287大田制種和SSR標(biāo)記試驗純度鑒定結(jié)合起來進行分析比較，首次嘗試采用多對SSR標(biāo)記精確鑒定兩優(yōu)287的種子純度及所含雜株類型定量分析。我們下一步擬采用這種方法，對每一個品種所有的雜株類型進行SSR標(biāo)記特性分析，初步建立每個品種的SSR標(biāo)記指紋庫，然后結(jié)合大田制種的實際情況，選取幾對SSR標(biāo)記進行種子純度及雜株類型定量分析，確保公司種子安全。

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