復(fù)發(fā)型翼狀胬肉IL-6與TNF-α的表達(dá)研究

程 鈺，高 偉，朱海峰

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，陜西西安710061；2.西安市第一醫(yī)院眼科，陜西西安710002）

復(fù)發(fā)型翼狀胬肉IL-6與TNF-α的表達(dá)研究

程 鈺1，2，高 偉2，朱海峰2

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，陜西西安710061；2.西安市第一醫(yī)院眼科，陜西西安710002）

目的探討復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中IL-6與TNF-α的表達(dá)變化及其臨床意義。方法采用酶標(biāo)記免疫吸附測定法（ELISA）分別檢測20例原發(fā)型和20例復(fù)發(fā)型患者翼狀胬肉組織的體外培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素IL-6與TNF-α的含量（24小時培養(yǎng)）。結(jié)果復(fù)發(fā)型翼狀胬肉組織培養(yǎng)上清中IL-6與TNF-α的含量分別為57.62±8.00 pg／mL與117.69±4.20 pg／mL，均高于原發(fā)型的41.22±5.21pg／mL與97.99±2.34pg／mL，且差異明顯（P＜0.08）。結(jié)論IL-6和TNF與翼狀胬肉的復(fù)發(fā)可能相關(guān)。

翼狀胬肉；白細(xì)胞介素6；腫瘤壞死因子α

翼狀胬肉（pterygium）是一種常見的眼表疾病，治療方式以手術(shù)為主，但是復(fù)發(fā)率較高，單純翼狀胬肉切除術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～50%［1］，因此，深入探究翼狀胬肉復(fù)發(fā)的原因成為迫切的現(xiàn)實需要。近期的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，外界環(huán)境中的危險因子（以紫外線照射為主，不排除風(fēng)沙、粉塵、花粉刺激、與感染等的影響）引起血管內(nèi)皮生長因子、炎癥因子的過度表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)野生型抑癌基因P53突變，可能是翼狀胬肉復(fù)發(fā)的原因，但是目前尚無定論［2］。IL-6和TNF-α是重要的炎癥因子，同時又是P53表達(dá)與變異影響的關(guān)鍵下游細(xì)胞因子，且P53對IL-6和TNF-α有著負(fù)調(diào)節(jié)作用［3］。因此，測定及比較原發(fā)與復(fù)發(fā)型翼狀胬肉組織中IL-6和TNF-α的含量，可初步探討炎癥因子與翼狀胬肉復(fù)發(fā)之間的聯(lián)系，并驗證P53與胬肉復(fù)發(fā)的相關(guān)性，為預(yù)防復(fù)發(fā)的藥物治療提供有益的靶點信息。

1 材料和方法

1.1 材料

二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-20AIC（SANYO），酶標(biāo)儀TecanF50（瑞士），超凈工作臺SW-CJ-2FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司），四季青無支原體優(yōu)級胎牛血清（上海越研生物科技有限公司），TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒（均為96人份，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 取材與培養(yǎng) 翼狀胬肉組織全部來自西安市第一醫(yī)院眼科住院部的初發(fā)和復(fù)發(fā)翼狀胬肉手術(shù)患者。第一組（A組），原發(fā)型（20例20只眼）；第二組（B組），復(fù)發(fā)型（20例20只眼）；兩組均無其它角膜、結(jié)膜疾患。復(fù)發(fā)翼狀胬肉患者第一次手術(shù)進(jìn)行翼狀胬肉切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)，手術(shù)均在我院進(jìn)行，術(shù)后3個月至1年后復(fù)發(fā)，盡量排除手術(shù)原因造成的復(fù)發(fā)。同時兩組患者在年齡、性別、職業(yè)以及居住地均進(jìn)行了配對以盡量減少實驗誤差。所有翼狀胬肉組織手術(shù)切除后迅速置于含100mL／L胎牛血清（FCS）的RPMI1640（Gibco）培養(yǎng)液（1.0mL）中。置于37℃溫箱孵育24h。

1.2.2 組織培養(yǎng)上清的制備 24h后取翼狀胬肉組織研磨勻漿，以2500r／min離心20min，收集上清，置于-20℃冰箱保存，IL-6和TNF-α含量待測。

1.2.3 ELISA法測定組織上清IL-6和TNF-α含量按照ELISA試劑盒說明配制洗滌液、底物工作液、標(biāo)準(zhǔn)品液。激活標(biāo)本后，分別建立IL-6、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定組織上清中與IL-6與TNF-α的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，每份標(biāo)本平行測定2孔，取平均值，各組間均數(shù)比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

初發(fā)與復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中IL-6和TNF-α含量見表1。

表1 各組IL-6和TNF-α含量的比較（ELISA）

由表1可見，與原發(fā)型比較，復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中IL-6和TNF-α含量均顯著升高，且差異明顯（P＜ 0.08）。

3 討論

當(dāng)前，翼狀胬肉手術(shù)從單純手術(shù)切除逐漸發(fā)展為羊膜移植、自體干細(xì)胞移植等眼表重建技術(shù)，其目的是盡快恢復(fù)角膜緣正常功能，恢復(fù)眼表正常環(huán)境，進(jìn)而防治復(fù)發(fā)。盡管如此，近年文獻(xiàn)報道胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高，對復(fù)發(fā)性翼狀胬肉的治療一直是眼科界的一項難題。因此，探討和研究翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要的理論和臨床意義。

現(xiàn)有研究表明，翼狀胬肉是基因遺傳、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、生長因子和病毒感染等多種機(jī)制共同作用的結(jié)果［4］，且國內(nèi)外對翼狀胬肉高復(fù)發(fā)率的原因尚未得出一致結(jié)論［5］。Coroneo等認(rèn)為翼狀胬肉的初發(fā)可以分為兩個階段［6］：第一階段，角膜緣干細(xì)胞受到破壞，角結(jié)膜屏障功能產(chǎn)生障礙；第二階段，細(xì)胞增生，并發(fā)生炎癥、血管化及結(jié)締組織重塑，角膜“結(jié)膜化”，產(chǎn)生翼狀胬肉。已經(jīng)確認(rèn)翼狀胬肉組織主要由大量增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成，并由其導(dǎo)致相應(yīng)的病變，而細(xì)胞因子則在炎癥反應(yīng)及成纖維細(xì)胞增生方面起到重要作用［7］。因此，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板等細(xì)胞代謝異常，以及白細(xì)胞介素IL-6和腫瘤壞死因子TNF-α等細(xì)胞因子的異常表達(dá)在翼狀胬肉形成過程中的作用不容忽視［4］。

考察翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)，在排除手術(shù)因素造成復(fù)發(fā)的情況后，目前僅能在基因遺傳、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、生長因子、以及術(shù)后淚膜功能的改變（干眼癥）諸方面進(jìn)行初步的歸納與分析。

第一，基于免疫反應(yīng)和生長因子的復(fù)發(fā)。根據(jù)Coroneo［6，7］和AI-Bdour［8］等學(xué)者對翼狀胬肉發(fā)病過程的論述，初步判斷其復(fù)發(fā)更符合“增生后變性”的特征。在以紫外線照射為主的危險因子（包括風(fēng)沙、粉塵、花粉刺激、感染等）的作用下，翼狀胬肉頭部成纖維細(xì)胞與血管大量增生，且成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及多種細(xì)胞因子相互作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子的異常分泌及球結(jié)膜的蛋白變性。所以，免疫因素在翼狀胬肉的發(fā)病過程中起到重要的作用。目前，在翼狀胬肉中檢測到的生長因子包括IL-6、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、和生長轉(zhuǎn)化因子（TGF-β）等。它們在正常細(xì)胞中不同程度的有序表達(dá)，但是在胬肉組織中表達(dá)紊亂［9］。其中，IL-6和TNF-α是一組重要的炎癥因子，可以促進(jìn)纖維母細(xì)胞的繁殖和血管的形成，而纖維母細(xì)胞的增生又能促進(jìn)IL-6和TNF-α的分泌表達(dá)，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)翼狀胬肉的發(fā)展。本課題數(shù)據(jù)表明，復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中IL-6和TNF-α含量較原發(fā)型均呈升高表達(dá)趨勢，說明對于復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者，其結(jié)膜組織中IL-6和TNF-α這兩個重要炎癥因子起著促進(jìn)纖維母細(xì)胞的繁殖和血管的形成作用，應(yīng)是造成翼狀胬肉復(fù)發(fā)的主要原因。同時我們還發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α的表達(dá)同時增高；而在通常狀態(tài)下，TNF-α是IL-6的強誘導(dǎo)劑，IL-6則對TNF-α起著抑制作用［10，11］。這很可能意味著復(fù)發(fā)型中其它細(xì)胞因子或危險因素促進(jìn)了TNF-α的高表達(dá)，而IL-6的分泌并非完全依賴于TNF-α誘導(dǎo)。這也說明在翼狀胬肉復(fù)發(fā)中存在著其它細(xì)胞因子或危險因素，胬肉復(fù)發(fā)可能是多種因素共同作用的結(jié)果，而IL-6和TNF-α等炎癥因子則成為它們共同作用的通路。

第二，基于基因遺傳的復(fù)發(fā)。近期研究證實，翼狀胬肉組織具有良性腫瘤組織的特性，且常見的引起人類腫瘤發(fā)生的突變型P53基因在翼狀胬肉上皮中過度表達(dá)［12］。本課題數(shù)據(jù)表明，復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中IL-6和TNF-α含量較原發(fā)型有明顯升高，可能說明單純翼狀胬肉切除術(shù)未能降低眼表組織中IL-6和TNF-α上游物質(zhì)（如P53基因等）的表達(dá)與突變水平。P53基因在紫外線等危險因子的刺激下變異并過度表達(dá)，會引發(fā)IL-6和TNF-α分泌表達(dá)的反復(fù)與紊亂，促使翼狀胬肉成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)可以傳代的生長變異性。故有學(xué)者認(rèn)為復(fù)發(fā)型翼狀胬肉組織細(xì)胞一定發(fā)生了轉(zhuǎn)化，具有與腫瘤相似的分子生物學(xué)特性，可以認(rèn)為是一種良性腫瘤性病變［13］。因此，我們推測翼狀胬肉治療方式除了手術(shù)切除外，似應(yīng)輔以抑制P53突變與過度表達(dá)的藥物治療，抑制IL-6和TNF-α的分泌，最終達(dá)到降低復(fù)發(fā)率的效果。

第三，基于術(shù)后淚膜功能改變（干眼癥）的復(fù)發(fā)。翼狀胬肉的生成可以引起結(jié)膜鱗狀上皮化生，杯狀細(xì)胞密度增加，影響淚膜表面的穩(wěn)定性。胬肉切除術(shù)也會影響淚膜功能［14］。Zakaria等研究顯示：淚膜功能改變（干眼癥）對胬肉的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用，是胬肉復(fù)發(fā)的重要危險因素之一［15］。眼表黏蛋白是一組高度糖基化的大分子蛋白質(zhì)，由角膜、結(jié)膜、淚器產(chǎn)生，是淚膜的重要成分，在抵御紫外線、干燥、化學(xué)品接觸的侵害方面起到重要作用。翼狀胬肉上皮處于高度增殖狀態(tài)，上皮細(xì)胞角化和增值活躍使細(xì)胞從分裂、移動、到成熟所需時間縮短。在此情況下，增殖的細(xì)胞沒有足夠的時間合成黏蛋白，導(dǎo)致淚液中黏蛋白含量降低，淚膜功能變化，形成干眼。單純胬肉切除術(shù)中，黏蛋白并未得到修復(fù)，可誘發(fā)干眼。干眼則會引發(fā)結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞分泌IL-6，TNF-α等致炎細(xì)胞因子，再通過基因遺傳、免疫反應(yīng)或生長因子途徑引起胬肉復(fù)發(fā)［16］。本課題的數(shù)據(jù)確認(rèn)了致炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α對翼狀胬肉復(fù)發(fā)的影響，也構(gòu)成干眼癥與翼狀胬肉復(fù)發(fā)相關(guān)性的必要條件之一。

翼狀胬肉的復(fù)發(fā)是一個復(fù)雜的病理過程，上述三種假設(shè)均建立在實驗基礎(chǔ)上，各有其合理性，而現(xiàn)實中翼狀胬肉的復(fù)發(fā)則很可能是三種途徑交互作用的結(jié)果。由于樣本量、樣本大小、實驗環(huán)境、個體差異等原因，可能某種或某幾種途徑占主導(dǎo)地位。但是，基于文獻(xiàn)報道結(jié)果和本課題的研究數(shù)據(jù)，證明IL-6和TNF-α與翼狀胬肉的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

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The study on expression of interleukin 6 and tumor necrosis factor-αin recurrent pterygium

CHENG Yu1，2，GAOWei2，ZHU Hai－feng2

（1.Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University School of Medicine，Xi'an，Shaanxi710061china；2.Department of Ophthalmology，the No.1 Hospital of Xi'an City，Xi'an，Shaanxi710002 china）

ObjectiveTo study the clinical significance of expression of interleukin 6（IL-6）and tumor necrosis factor α（TNF-α）in palindromic pterygium.M ethods Group A included twenty patients'（20 eyes）idiopathic pterygia tissues，and group B covered twenty patients'（20 eyes）palindromic pterygia tissues.After being cultured for 24 hours，tissue supernatant of both groupswas tested for the content of IL-6 and TNF-αby enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）technique.Results The contents of IL-6 and TNF-αin tissue supernatantof group B were 57.62 ±8.00 pg／mL and 117.69±4.20 pg／mL，respectively，which were significantly higher than those of group A（41.22±5.21 pg／mL and 97.99±2.34 pg／mL，respectively，P＜0.08）.Conclusions The expression of IL-6 and TNF-αis probably related to the recurrence of pterygium.

Pterygium；Interleukin 6（IL-6）；Tumor necrosis factorα（TNF-α）

R285.5

A

1672－2639（2012）02－0001－03

2012－04－23；責(zé)任編輯 趙菊梅］