HMGB1、MMP－9在肺癌組織的表達(dá)及臨床意義

郝靜靜，張彩蓮

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，陜西延安716000）

HMGB1、MMP－9在肺癌組織的表達(dá)及臨床意義

郝靜靜，張彩蓮

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，陜西延安716000）

目的探討肺癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的表達(dá)及其意義。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)65例肺癌組織及其癌旁對(duì)照組中HMGB1和MMP－9的表達(dá)。結(jié)果非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中HMGB1及MMP－9陽(yáng)性率明顯高于其癌旁組織（P＜0.05）；HMGB1在肺鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于腺癌組織，且其癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率也高于腺癌的癌旁組織（P＜0.05）；MMP－9在肺鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率低于腺癌組織（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中HMGB1及MMP－9陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織（P＜0.05）；HMGB1及MMP－9在肺癌組織中的表達(dá)成正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論HMGB1和MMP－9的表達(dá)與肺癌組織病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為肺癌轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后判斷指標(biāo)。

肺癌；高遷移率族蛋白1；基質(zhì)金屬蛋白酶9

肺癌是目前全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居各惡性腫瘤首位，侵襲和轉(zhuǎn)移是晚期肺癌患者死亡的主要原因。高遷移率族蛋白－1（highmobility group box－1，HMGB－1）近年的研究表明其參與細(xì)胞的分化、遷移、再生，與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［1］密切相關(guān)。此外，細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellmatrix，ECM）在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，而金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）通過(guò)對(duì)ECM的降解可促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶－9（matrix metallo proteinase－9，MMP－9）是MMPs中相對(duì)分子質(zhì)量最大的酶，其主要功能就是降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，與腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)［2］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)肺癌組織中有無(wú)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討HMGB1以及MMP－9與肺癌生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床治療和預(yù)后提供判斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

65例標(biāo)本均來(lái)自延安大學(xué)附屬醫(yī)院2009－01～2012－04在胸外科行手術(shù)切除及門診行纖支鏡活檢的并經(jīng)病理診斷確診的肺癌患者，收集病理標(biāo)本的存檔蠟塊。其中男41例，女24例，年齡41～75歲。病理組織分型：鱗癌34例，腺癌31例。病理分級(jí)：高分化18例，中分化28例，低分化19例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。對(duì)以上65例患者同時(shí)取癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制成蠟塊保存?zhèn)溆?。HMGB1及MMP9多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)買于北京博奧森生物試劑有限公司。HMGB1多克隆抗體的工作濃度為1：50，MMP－9多克隆抗體工作濃度為1∶100。

1.2 檢測(cè)方法

采用SP二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。主要步驟如下：標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水，4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（片厚4μm）。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、抗原熱修復(fù)；冷卻至室溫后PBS沖洗3次，滴加3%去離子水孵育15～20 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次；滴加A試劑（封閉用正常山羊血清工作液），37℃15～20 min，傾去勿洗，滴加一抗，4℃過(guò)夜，室溫放置1 h，PBS沖洗3次，加B試劑（生物素化二抗工作液），37℃15～20 min，PBS沖洗3次，加C試劑（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液），37℃15～20 min，PBS沖洗3次，應(yīng)用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片.以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

HMGB1蛋白主要定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕色染色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)癌細(xì)胞總數(shù)和表達(dá)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分率≥30%為陽(yáng)性（＋），＜30%為陰性（－）；MMP－9蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色程度進(jìn)行結(jié)果判定［3］。按陽(yáng)性細(xì)胞比例判定：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%1分，10%～50% 2分，＞50%3分；按染色程度判定：陰性為0分，淡黃色1分，中度黃色2分，棕黃色3分。兩項(xiàng)相乘＜3為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1及MMP－9的表達(dá)情況

HMGB1主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，成淡黃色至棕褐色。MMP－9主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，成淡黃色至棕褐色。兩者的癌旁細(xì)胞也有少部分表達(dá)。HMGB1及MMP－9在不同部位的表達(dá)情況見(jiàn)表一及下圖1。

圖1 HMGB1 MMP－9在肺癌組織中的表達(dá)

表1 NSCLC組織中HMGB1、MMP－9的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.2 相關(guān)性分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，NSCLC組織中HMGB1的表達(dá)與MMP－9的表達(dá)成正相關(guān)（r＝0.424，P＜0.005）。

3 討論

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，而近年的研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B1與腫瘤的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，其在多種腫瘤細(xì)胞和未成熟細(xì)胞中表達(dá)豐富［4］。有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的淋巴及血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5，7］。本研究結(jié)果顯示：65例NSCLC組織中HMGB1陽(yáng)性表達(dá)率為61.54%（40／65），高于其癌旁對(duì)照組的52.50%（21／40），（P＜0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HMGB1陽(yáng)性表達(dá)率也高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），說(shuō)明HMGB1在人NSCLC組織中高表達(dá)，且與肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，34例鱗癌組織的HMGB1陽(yáng)性表達(dá)率76.47%高于其癌旁對(duì)照組的44.12%，（P＜0.05），腺癌組織的HMGB1陽(yáng)性表達(dá)率45. 16%也高于其癌旁對(duì)照組的19.35%，（P＜0.05）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示，鱗癌癌旁HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率為44.12%（15／34）高于腺癌癌旁HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率為19.35%（6／31），（P＜0.05）。考慮可能系鱗癌易發(fā)生壞死、出血，壞死的腫瘤細(xì)胞向周圍組織釋放HMGB1所致。

Liotta等［8］提出腫瘤侵襲三步學(xué)說(shuō)，即粘附、降解和移動(dòng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要步驟，近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中的重要酶類，與多種病理過(guò)程尤其是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。MMP－9是MMPs中分子量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，使瘤細(xì)胞可沿著缺失的基膜向周圍組織浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；另一方面可通過(guò)促進(jìn)腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管新生，使腫瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)散［9，10］。本研究結(jié)果顯示：MMP－9在肺腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率83.87%（26／31）高于肺鱗癌58.82%（20／34），（P＜0.05），并且，肺鱗癌和腺癌的MMP－9陽(yáng)性表達(dá)率分別高于其癌旁對(duì)照組的32.35%（11／34）和25.81%（8／31）（P＜0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MMP－9的陽(yáng)性表達(dá)率也高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1、MMP－9與腫瘤的分化程度以及性別、年齡無(wú)關(guān)。而統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析顯示：NSCLC組織中HMGB1的表達(dá)與MMP－9的表達(dá)成正相關(guān)（r＝0. 424，P＜0.005），提示二者均在肺癌中高表達(dá)，且與的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且可能有一定的關(guān)聯(lián)性。

總之，肺癌組織中HMGB1和MMP－9均呈高表達(dá)，高于其癌旁對(duì)照組，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞二者的陽(yáng)性表達(dá)率也高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。說(shuō)明其與腫瘤侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)HMGB1、MMP－9可能有助于評(píng)估肺癌的預(yù)后，并且以二者為靶點(diǎn)的腫瘤治療，值得進(jìn)一步深入研究。

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Expression of HMGB1 and lung and their clinical sighificance

Hao Ging－jing，Zhang Cai－lian

（Department of Gerontology Disease，Yanan Affiliated Hospital，Yanan city 71600）

ObjectiveTo investigate the expression ofMMP－9 and HMGB1 in lung carcinoma tissue and their sighificances.Methods The expression of HMP－9 and HMGB1 was detected in 65 lung carcinoma tissues and its para－cancerous normal lung tissues by immunohistochemicalmethod.Results The expression of MMP－9 and HMGB1 in lung carcinlma tissueswas significantly higher than that in para－cancerous normal lung tissues（P＜0.05）；The expression of HMGB1 was higher in squamous than that in adenocarcinoma carcinoma（P＜0.05）and The expression of its para－cancerous normal lung tissueswas higher than para－cancerous normal lung thssues of adenocarcinoma（P＜0.05）.The expression of MMP－9 was lower in adenocarcinoma than than in squamous carcinoma（P＜0.05）.The expression of MMP－9 and HMGB in lung carcinoma tissueswith lymph nodemetastasis was sighificantly higher than sthose without lymphatic metastasis（P＜0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that the expression of HMGB1 had abviouspositive correlation with the expression ofMMP－9（P＜0.05）.ConclusionThe expression rate of HMG B1 AND mmp－9 was correlated with lung cancer pathological types and lymph nodemetastasis，and can be an indication of lung cancer invasion，metastasis，prognosis and prognosis.

lung cancer；MMP－9 HMGB1

R734.2

A

1672－2639（2012）04－001－03

2012－09－25；責(zé)任編輯 趙菊梅］