有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練影響大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能機(jī)制的研究＊

祖 晶,劉建軍

(1.淮陰師范學(xué)院體育學(xué)院,江蘇 淮安 223300;2.上海對(duì)外貿(mào)易學(xué)院體育部,上海 201600)

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有產(chǎn)生舒縮血管活性物質(zhì),調(diào)節(jié)血管張力的功能,內(nèi)皮源性舒張因子主要有一氧化碳(nitric oxide NO),前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)以及內(nèi)皮依賴性超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor,EDHF)等 ,血管內(nèi)皮源性收縮和舒張因子是否平衡直接影響了血管張力。動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮的損傷,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是改善心血管健康,預(yù)防和輔助治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效手段。目前認(rèn)為有氧運(yùn)動(dòng)改善心血管健康主要通過(guò)NO途徑實(shí)現(xiàn),但確切機(jī)制并不十分清楚,直接測(cè)定有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)脈反應(yīng)的研究不多,更少有同時(shí)測(cè)定對(duì)動(dòng)脈3條舒張途徑的影響。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定有氧運(yùn)動(dòng)后,大鼠胸主動(dòng)脈經(jīng)NO、PGI2途徑以及 EDHF途徑舒張功能的改變,探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈舒張影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

8周大的雄性SD大鼠12只,由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所提供,體重250～270g,常規(guī)飼養(yǎng),室溫控制在19～23℃,光照-黑暗周期為12 h/12 h,每天適應(yīng)性游泳訓(xùn)練15 min,每周5次,適應(yīng)性訓(xùn)練一周后隨機(jī)分成2組(n=6),分為常氧不運(yùn)動(dòng)組(N)、常氧訓(xùn)練組(EX)。EX組進(jìn)行8周的游泳訓(xùn)練 ,每次 1 h,每周5次。

1.2 儀器與試劑

HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng),BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),張力換能器(JH-2,10g),TG L-16G型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

苯腎上腺素(phenylephrine,PE),乙酰膽堿(acetylcholine,Ach),L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine Methyl Ester,LNAME),吲哚美辛(indomethacin,Indo),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、apamin、charybdotoxin均為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑購(gòu)自南京德寶生化器材有限公司。除Indo先用DMSO初溶,其余均用K-H液溶解,所有試劑使用前用 KH液稀釋。

K-H緩沖液(mmol/L)組成:NaCl 118,NaHCO325,KCl 4.8,MgCl21.2,KH2PO41.2,CaCl22.5,G lucose 11.7,溶液均為新鮮配制。

1.3 分離動(dòng)脈環(huán)

在規(guī)定的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練完成后,2組大鼠分別予腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉處死,立即行開胸分離出心臟,放置在 K-H緩沖液中,剪開心包膜,分離出胸主動(dòng)脈,于主動(dòng)脈弓下0.5 cm處切下1段2 mm長(zhǎng)的胸主動(dòng)脈環(huán)(內(nèi)徑不小于1.0mm),不能過(guò)分牽拉血管,以確保內(nèi)皮的完整。

1.4 胸主動(dòng)脈環(huán)收縮-舒張反應(yīng)系統(tǒng)的建立

器官浴槽中盛有5 ml的pH 7.4,37℃K-H緩沖液,并持續(xù)充以95%O2和5%CO2的混合氣,建立一個(gè)測(cè)定動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)變化的系統(tǒng)。所有的動(dòng)脈環(huán)用細(xì)線,懸掛于恒溫器官浴槽內(nèi),一端掛鉤連接張力傳感器,并與BL-420E+實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連,持續(xù)測(cè)定血管張力;另一端與一可移動(dòng)裝置相連,進(jìn)行調(diào)零、定標(biāo)、穩(wěn)定、平衡、預(yù)激,以此將血管張力調(diào)節(jié)至靜止?fàn)顟B(tài)下的1.5 g。將動(dòng)脈環(huán)在緩沖液中平衡60min,在這個(gè)過(guò)程中每隔15 min換一次緩沖液。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

經(jīng)60min平衡后,每5 min向緩沖槽中加入PE(10-6mol/L),Ach(10-6mol/L),檢測(cè)標(biāo)本活性(收縮幅度<20%者棄去),以確保動(dòng)脈收縮性能和內(nèi)皮的完整。然后將動(dòng)脈環(huán)沖洗2次,使其張力恢復(fù)到基線水平。

在緩沖槽中加入PE(10-6mol/L),使動(dòng)脈環(huán)處于預(yù)收縮狀態(tài),此PE濃度與KCl(80mmol/L)引起的血管最大收縮力相當(dāng)。當(dāng)動(dòng)脈環(huán)預(yù)收縮達(dá)到平臺(tái)后,通過(guò)蓄積方式加入濃度增遞的Ach,根據(jù)血管的舒張程度來(lái)評(píng)定血管的功能。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PE為10-6mol/L時(shí)可以引起血管持續(xù)而穩(wěn)定的收縮達(dá)1 h,而10-5mol/L的PGI2抑制劑 Indo,10-6mol/L的NO抑制劑L-NAME,以及10-7mol/L和3×10-8mol/L的 EDHF抑制劑apamin和charybdotoxin,可以完全阻斷Ach引起的血管舒張反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)時(shí)在浴槽中預(yù)先加入兩條舒張途徑的抑制劑,孵育30min,濃度增遞法加入Ach(10-9～10-4mol/L),分別觀察NO、PGI2和EDHF途徑的動(dòng)脈舒張功能。每次加藥前需將動(dòng)脈環(huán)沖洗干凈,使血管張力恢復(fù)至基線水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

浴槽中先加入PE引起血管收縮,濃度增遞法加入Ach得到濃度舒張曲線,計(jì)算各濃度Ach引起的舒張百分率。舒張百分率=不同濃度Ach引起的血管舒張數(shù)值/預(yù)先使用PE引起的血管收縮數(shù)值×100%。比較的指標(biāo)為Rmax(最大舒張百分率)和 EC50(產(chǎn)生一半最大舒張百分率時(shí)所需要Ach濃度的負(fù)對(duì)數(shù)),結(jié)果以表示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS 13.0進(jìn)行分析,兩組之間采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胸主動(dòng)脈環(huán)的收縮反應(yīng)

兩組動(dòng)脈環(huán)對(duì)80mmol/L的 K+收縮值分別為(2.24±0.23)g和(2.56±0.57)g;對(duì)10-6mol/L的 PE收縮值分別為(2.36±0.24)g和(2.67±0.33)g,兩組比較均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 動(dòng)脈環(huán)總的內(nèi)皮依賴性舒張

兩組動(dòng)脈環(huán)在PE作用預(yù)收縮情況下,對(duì)加入的Ach產(chǎn)生濃度依賴性舒張反應(yīng)。相對(duì)于對(duì)照組大鼠的Rmax值81.97%±0.78%,運(yùn)動(dòng)組大鼠的Rmax值91.12%±0.98%顯著增高(P<0.05,表1,圖1),同時(shí)運(yùn)動(dòng)組對(duì)Ach的敏感性也有明顯提高(P<0.05),表明運(yùn)動(dòng)組胸主動(dòng)脈對(duì)Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)更明顯。

Fig.1 Relaxation effects to Ach in rings of thoracic aorta obtained from sedentary(N)or exercised(EX)rats

Tab.1 Relaxation to acetylcholine in thoracic aorta rings from sedentary and exercised rats(,n=6)

Tab.1 Relaxation to acetylcholine in thoracic aorta rings from sedentary and exercised rats(,n=6)

N:Sedentary rats;EX:Exercised rat;EC50:Sensitivity is expressed as negative log of dose inducing 50%of maximal relaxation;Rmax:Percent of maximal relaxation;NO:Nitric oxide;PGI2:Prostacyclin;EDHF:endothelium-derived hyperpolarizing factor＊P<0.05vscontrol

T otal relaxation ratio EC50(-log mol/L)Rmax(%)NO-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)PGI2-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)EDHF-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)EX 7.78±0.21＊ 91.12±0.98＊ 7.20±0.12＊ 76.97±0.64＊ 5.71±0.19＊ 12.48±0.42＊ 3.16±0.02 6.50±0.07 N 7.26±0.13 81.97±0.78 6.15±0.10 69.75±0.57 4.82±0.07 10.06±0.26 3.02±0.01 6.25±0.05

2.3 NO途徑介導(dǎo)的舒張

阻斷PGI2和 EDHF途徑后測(cè)定NO介導(dǎo)的舒張作用,發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組動(dòng)脈環(huán)的 Rmax為76.97%±0.64%較對(duì)照組69.75%±0.57%顯著增高(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組對(duì)Ach的敏感性也明顯提高(P<0.05),表明運(yùn)動(dòng)組胸主動(dòng)脈經(jīng)NO途徑的舒張反應(yīng)更明顯,且對(duì)NO的敏感性也有所提高。

2.4 PGI2途徑介導(dǎo)的舒張

阻斷NO和EDHF途徑后測(cè)定PGI2途徑介導(dǎo)的舒張作用,發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組動(dòng)脈環(huán)的Rmax為12.49%±0.42%較對(duì)照組10.06%±0.26%顯著增高(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)組對(duì)Ach的敏感性也明顯提高(P<0.05),表明運(yùn)動(dòng)組胸主動(dòng)脈經(jīng)PGI2途徑的舒張反應(yīng)更明顯,對(duì)PGI2的敏感性也有所提高。

2.5 EDHF途徑介導(dǎo)的舒張

阻斷PGI2和NO途徑后測(cè)定EDHF途徑介導(dǎo)的舒張作用,發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組動(dòng)脈環(huán)的Rmax為6.50%±0.07%較對(duì)照組6.25%±0.05%沒(méi)有明顯變化。運(yùn)動(dòng)組對(duì)Ach的敏感性也沒(méi)有明顯變化,表明運(yùn)動(dòng)組胸主動(dòng)脈對(duì)Ach誘導(dǎo)的經(jīng)PGI2途徑的舒張反應(yīng)變化不明顯。

3 討論

運(yùn)動(dòng)鍛煉可使得心血管產(chǎn)生適應(yīng)性的改變[1],但其確切機(jī)制還有待于深入探討。Ach可誘導(dǎo)各種內(nèi)皮依賴性舒張因子如NO、PGI2和EDHF的釋放,但不同部位的血管,這三個(gè)途徑的作用并不等同[2]。本實(shí)驗(yàn)分別阻斷特定通路,直接測(cè)定有氧運(yùn)動(dòng)后大鼠動(dòng)脈舒張功能的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組大鼠動(dòng)脈經(jīng)NO途徑的舒張均占總舒張反應(yīng)的70%以上,兩者無(wú)明顯差異,提示有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠動(dòng)脈舒張功能的改善作用仍以NO途徑為主,證實(shí)了他人的結(jié)果[3]。對(duì)照組大鼠動(dòng)脈經(jīng)PGI2途徑的舒張約占總舒張效應(yīng)的12%,而運(yùn)動(dòng)組上升到近15%,經(jīng)PGI2途徑的Rmax值也明顯提高,這表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)皮環(huán)氧合酶系統(tǒng)有一定的增強(qiáng)作用,與他人的結(jié)果一致[4]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組大鼠EDHF介導(dǎo)Ach引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張中作用有限,均少于總舒張反應(yīng)的10%,提示EDHF途徑在胸主動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張中作用比較小,與Yen等人[5]的研究結(jié)果不同,分析原因他們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是有動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的高血壓模型大鼠。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的改善主要是由NO和PGI2兩條途徑介導(dǎo)的。今后需要進(jìn)一步明確這種特定的內(nèi)皮適應(yīng)的確切機(jī)制。

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