PESV干預K562細胞PI3K/Akt信號通路凋亡調(diào)控的研究*

張 蕾 ，楊文華 ，于文俊，郝 征 ，張 佳

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

PESV干預K562細胞PI3K/Akt信號通路凋亡調(diào)控的研究*

張 蕾1，楊文華1，于文俊2，郝 征2，張 佳2

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

[目的]探討PESV對K562細胞PI3K/Akt信號蛋白及凋亡調(diào)控因子Bcl-2和Bad表達的影響。[方法]將體外培養(yǎng)K562細胞，經(jīng)PESV處理不同時間后，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Western blot檢測PI3K及p-Akt蛋白水平變化，實時熒光定量RT-PCR檢測Bcl-2、BadmRNA水平變化。[結(jié)果]與對照組相比，PESV處理后K562細胞凋亡率顯著增加，PI3K及p-Akt表達降低，抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2mRNA表達降低，促凋亡基因BadmRNA表達增加。[結(jié)論]PESV可能通過降低PI3K、Akt信號蛋白表達，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bad表達，抑制K562細胞增殖，促進其凋亡。

PESV；K562 細胞系；凋亡；PI3K；Akt；Bcl-2；Bad

慢性粒細胞白血病（CML）簡稱“慢?！?，是起源于多功能造血干細胞的惡性增殖性疾病。Ph染色體自1960年在CML中被發(fā)現(xiàn)后，成為第一個被認識的與惡性疾病相關(guān)的細胞遺傳學改變。90%以上的慢?；颊咧锌砂l(fā)現(xiàn)有Ph染色體，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因，BCR/ABL介導的Ph染色體畸變被認為是CML的始動突變[1]。BCR/ABL融合基因表達的編碼210 KD的BCR/ABL融合蛋白（p210）具有高度酪氨酸激酶活性，激活下游PI3K/Akt信號通路，并最終影響細胞核內(nèi)調(diào)控凋亡和生存相關(guān)基因的表達，使多種癌基因表達異常,抑制白血病細胞的凋亡，最為常見的是B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族的信號分子，包括抑制細胞凋亡的因子（Bcl-2、Bcl-xl）和促進細胞凋亡的因子（Bad）等。筆者前期的研究證實蝎毒多肽提取物（PESV）在體內(nèi)體外均能對白血病細胞有明顯的促進凋亡的作用[2-3]。本研究探討PESV對K562細胞的凋亡效應，以及對PI3K及p-Akt蛋白水平表達，及凋亡調(diào)控因子Bcl-2和Bad表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI1640、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Annexin V/PI雙染流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；PI3K、p-Akt一抗購自英國ABCAM公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒及SYBR Green熒光染料MIX購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 藥物制備 PESV系將蝎毒粗毒應用分子篩層析技術(shù)提純所得，為分子量6 000～7 000的多肽混合物，純度為89.1%，使用前用生理鹽水溶解稀釋到所需濃度。

1.1.3 細胞系 人慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞系有中國醫(yī)學科學院血液學研究所提供，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng);均在37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境孵育。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 K562白血病細胞培養(yǎng) K562白血病細胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含10%FBS），按常規(guī)方法培養(yǎng)。實驗時均取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 凋亡細胞檢測 收集對數(shù)生長期細胞，離心計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1.0×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔體積800μL。實驗組（A組）加入PESV 20μg/mL，陽性對照環(huán)磷酰胺（CTX）組（B組）加入CTX作用K562，空白對照生理鹽水組（C組）加入生理鹽水200μL。取24、48、72 h 3個時間點，各自取細胞離心5min，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，調(diào)節(jié)細胞濃度為5.0×105/mL，加入-20℃預冷70%乙醇2mL固定，RNase消化，4℃放置24h，PBS洗2次。每管加入PI，ANNEXIN-V雙染色，計數(shù)1×104個細胞，檢測細胞凋亡率，用FACSCan流式細胞儀檢測和分析凋亡細胞，同時以不加ANNEXIN-V及PI的一管作為陰性對照。

1.2.3 Western印記實驗 收集上述3組24、48、72 h 3個時間點K562細胞，離心計數(shù)，進行Western blot檢測。進行總蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，按每泳道40mg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用TBS-T（含 0.2%Tween20，5%脫脂奶粉）封閉 1 h；分別加入PI3K和Anti-phospho-AKT（Ser473）單克隆抗體，二抗，孵育，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，應用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件分析條帶灰度值，除以β-actin內(nèi)參蛋白值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白相對含量。

1.2.4 實時熒光定量RT-PCR 1）收集上述不同組3個時間點K562細胞，TRIZOL提取細胞總RNA,電泳鑒定RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2）實時熒光定量PCR反應：S YBR反應體系共20μL。反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30秒，55℃30秒，40個循環(huán)，72℃20秒，設空白對照。各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)即為 Ct值。根據(jù) ΔC（t）=C（t）目的基因-C（t）β-actin，ΔΔC（t）=2-ΔC（t）計算目的基因與β-actin相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 Primer sequenceof PCR

1.2.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PESV對K562細胞凋亡的影響 K562細胞出現(xiàn)時間依賴的凋亡現(xiàn)象。白血病細胞經(jīng)藥物處理24 h時，即可見到凋亡細胞上升，凋亡細胞百分比由3.63%上升到7.21%，并隨時間延長而繼續(xù)升高，至72 h時達到34.26%（P<0.05）。FCM定量顯示，PESV作用后隨時間的延長,凋亡細胞增多，在各時點，A組與B組及C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。與24 h處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 PESV對K 562細胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

表2 PESV對K 562細胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

注：與同時點的各空白組比較，*P<0.01；與同時點的CTX陽性對照組比較，△P<0.05。

組別 凋亡率24 h 48 h 72 h A 組 3.63±0.82*△ 7.21±1.69*△ 34.26±12.14*△B 組 2.26±0.48△□ 5.85±1.43△□ 22.17±9.340△□C 組 0.48±0.25△□ 1.36±0.64△□ 04.46±1.620△□

2.2 Western blot檢測 PESV對K562細胞PI3K和Anti-phospho-Akt（Ser473）蛋白的影響。各組蛋白印記清楚，PI3K分子量85KD，p-Akt分子量56KD，內(nèi)參蛋白actin 43KD，內(nèi)參條帶圖像清晰均一。A組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在隨時間延長而減少，呈現(xiàn)明顯的時間依賴性；B組3個時間點PI3K蛋白含量在隨時間延長而減少，在24、72 h兩個時間點表達量均明顯高于A組（P<0.05）；C組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在隨時間延長而逐漸增加，且3個時間點均高于A、B組（P<0.05），如表3。A 組K562細胞24、48、72 h p-Akt蛋白含量在隨時間延長而減少，呈現(xiàn)較明顯的時間依賴性；B組24 h p-Akt蛋白含量較高,在48、72 h兩個時間點表達降低，但仍明顯高于A組（P<0.05）；C組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在3個時間點均高于 A、B 組（P<0.05），如圖 1。

表3 各組不同時間點蛋白相對表達量分析結(jié)果Tab.3 Resultsof the analysisof protein relative expression in each group at different time points

2.3 實時熒光定量RT-PCR法檢測PESV對K562細胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2與BadmRNA的表達量的影響 PESV組應用熒光定量RT-PCR檢測K562細胞Bcl-2mRNA，其變異系數(shù)（CV）介于1.21%～8.65%之間，分布良好。CT值為28.51～31.193（中位30.07），24、48、72 h 相對含量 RQ 值平均值分別為1.205、0.769、0.740。各時間點與陽性對照組和空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組K 562細胞Bcl-2m RNA表達情況Tab.2 Expression ofBcl-2mRNA in K 562 cellsineachgroup

PESV組應用熒光定量RT-PCR檢測K562細胞BadmRNA，其變異系數(shù)（CV）介于0.77%～7.24%之間，分布良好。CT 值為 24.712～28.92（中位 26.35），24、48、72 h相對含量RQ值平均值分別為2.015、3.443、6.934。各時間點與陽性對照組和空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

圖3 各組K 562細胞BadmRNA表達情況Fig.3 Expression ofBadmRNA in K 562 cellsin each group

3 討論

根據(jù)其臨床表現(xiàn)慢性粒細胞白血病屬于“積聚”、“瘰疬”等范疇。其病機為風濕毒邪循經(jīng)流注，風濕互結(jié)，閉阻脈絡，毒損絡脈之證，治以祛風除濕、解毒通絡。全蝎性味咸辛平、有毒，具有熄風祛濕、解毒通絡之功，為以毒治毒之要藥。全蝎的有效成分蝎毒多肽（PESV），本研究中發(fā)現(xiàn)PESV作用后K562細胞生長受到抑制，并且作用時間與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。

90%以上的慢?；颊咧锌砂l(fā)現(xiàn)有Ph染色體，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因[4]，BCR/ABL介導的Ph染色體畸變被認為是CML的始動突變。BCR/ABL融合基因中,主要由ABL段攜帶細胞惡變的主要信息，而BCR段的斷裂位點主要影響疾病表型[5]，不同的BCR/ABL融合基因類型與疾病表型相關(guān)[6-7]。PI3K/Akt信號通路作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，通過影響下游通路，滅活caspase、誘導細胞周期素等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或其轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的生成及調(diào)控Bcl-2家族成員Bad、Bcl-2、及Bcl-xL表達的平衡等，在細胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖的關(guān)鍵作用，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。

PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用，進一步激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase9、NF-κB等，而介導胰島素、多種生長因子等誘發(fā)的細胞生長，經(jīng)多種途徑促進細胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[10-11]。凋亡前體蛋白Bad是第一個被發(fā)現(xiàn)的由Akt靶向作用，并與凋亡有關(guān)的蛋白，是Akt的下游因子。Bad是Bcl-2家族成員之一，分布于線粒體外膜在細胞凋亡的調(diào)控上發(fā)揮重要作用[12]。當Akt未活化時，Bad可與Bcl-2形成復合體而表現(xiàn)促凋亡活性[13]?；罨腁kt磷酸化Bcl-2家族中的Bad Ser136位點，引起B(yǎng)ad與伴侶蛋白（Chaperone）14-3-3結(jié)合，從而阻斷Bad與Bcl-2形成二聚體,使Bad不能發(fā)揮促細胞凋亡作用，而游離的抗凋亡因子Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用[14]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)PESV能顯著降低K562細胞的PI3K，p-Akt的表達，有一定的時間依賴性。兩個蛋白的表達隨PESV作用時間的延長下調(diào)更為明顯，與其誘導凋亡的效應相一致，其效應均優(yōu)于環(huán)磷酰胺。說明PESV較好的抑制了PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑及該通路作用的下游通路，從而通過影響調(diào)控因子促進K562細胞的凋亡。同時本研究證實，PESV在通過抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性進而誘導K562細胞凋亡過程中對抗凋亡蛋白Bcl-2表達有下調(diào)作用，且呈時間依賴性，同時伴有促凋亡蛋白Bax的表達升高，導致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使細胞走向凋亡。

慢性粒細胞白血病的發(fā)病機制提示筆者通過研制新的酪氨酸激酶抑制因子，抑制蛋白酶體或通過作用于BCR/ABL下游的靶向信號途徑[15]，對慢性粒細胞白血病的治療可能是一個新的有效的途徑，也為治療慢粒尋找基因靶向治療藥物提供了思路。本研究在一定程度闡明中藥全蝎提取物PESV促進慢性粒細胞白血病細胞的凋亡，干預PI3K、p-Akt信號蛋白表達，進而起到調(diào)控下游信號因子Bcl-2與Bad的表達，起到促進人慢性粒細胞白血病細胞K562細胞凋亡的作用。

[1]張之南.血液病學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：12.

[2]楊文華，王慧娟，楊向東，等.蝎毒多肽對白血病細胞黏附及侵襲特性的影響[J].中華血液學雜志，2009，30（6）：424－425.

[3]楊文華，楊向東，史哲新，等.蝎毒多肽提取物對白血病小鼠Bcl-2、SDF-1α 與 TGF-β1表達的影響[J].中國腫瘤臨床，2010，50（8）：429－432.

[4]Kurzrock R，Kantarjian HM，Druker BJ，et al.Philadelphia chromosome-positive leukemias:from basicmechanisms to molecular Therapeutics[J].Ann Intern Med，2003，138(10):819-830.

[5]Kantarjian HM,Cortes JE,魻Brien S,etal.Long-term survivalbenefitand improved complete cytogenetic and molecular response rates with imatinib mesylate in Philadephia chromosome positve chronic phase chronicmyeloid lekemia after failure of interferonalpha[J].Blood,2004,104(7):1979.

[6]Hirano I,Nakamura S,Yokota D.Depletion of pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1 and 2 by Bcr/abl promotes chronic myelogenous leukemia cell proliferation through continuous phosphorylation of Akt isoforms[J].JBiol Chem,2009,284(33):22155-22165.

[7]Ritchie E,Nichols G.Mechanisms of resistance to imatinib in CML patients:a paradigm for the advantages and pitfalls ofmolecularly targeted therapy[J].Curr Cancer Drug Targets,2006,6(8):645-657.

[8]Blanco-Aparicio C,Peque O B,Moneo V,et al.Inhibition of phosphatidylinositol-3-kinase synergizeswith gemcitabine in lowpassage tumor cell lines correlating with Bax translocation to the mitochondria[J].Anticancer Drugs,2005,16(9):977-987.

[9]Montiel-Duarte C,Cordeu L,Agirre X,etal.Resistance to Imatinib Mesylate-induced apoptosis in acute lymphoblastic leukemia is associated with PTEN down-regulation due to promoter hypermethylation[J].Leuk Res,2008,32(5):709-716.

[10]Sale EM,Hodgkinson CP,Jones NP,et al.A new strategy for studying protein kinase B and its three informs Role of protein kinase-B in phosphorylating glycogen synthase kinase-3,tuberin,WNK1,and ATP citrate lyase[J].Biochemistry,2006,45(1):213-223.

[11]Zhang H,BajraszewskiN,Wu E,etal.PDGFRsare critical for PI3K/Aktactivation and negatively regulated bymTOR[J].JClin Invest,2007,117(3):730-738.

[12]Mayo LD,Donner DB.A phosphatidy linositol 3-kinase/Akt pathway promotes translocation ofmdm2 from the cyto-plasm to the nucleus[J].Proc NatlAcad SciUSA,2001,98(20):11598-11603.

[13]Sawa H,Kobayashi T,Mukai K,etal.Bax overexpression enhances cytochrome crelease from mitochondria and sensitizes KATO III gastric cancer cells to chemotherapeutic agent-induced apoptosis[J].Int JOncol,2000,16(4):745-749.

[14]Peltier JO,NeillA,Schaffer DV.PI3K/Aktand CREB regulateadult neural hippocampal progenitor proliferation and differentiation[J].DevelopmentalNeurobiology,2007,67(10):1348-1361.

[15]Aichberger kJ,Mayerhofer M,Krauth MT,et al.Low-level expression of proapoptotic Bcl-2-interactingmediator in leukenic cells in patientswith chronicmyeloid leukemia;role of BCR/ABL,characterization of underlying signaling pathways,and expression by novel pharmacologic compounds[J].Cancer Res,2005,65(20):9436-9444.

Study on PI3K/Aktmessenger passage and apoptosis controlling in PESV-preconditioned K 562 cells

ZHANGLei1,YANGWen-hua1,YUWen-jun2,HAOZheng2,ZHANG Jia2
（1.The FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chin a）

[Objective]To investigate the effectof PESV on the expression ofmassage protein PI3K/Akt,apoptosis regulators Bcl-2 and Bad expression in K562 cells.[Methods]In vitro cultured K562 cells preconditioned with PESV for different timeswere determined for cellapoptosis ratewith cytoflowmeter,the level of PI3K and p-AKT protein with Western blotand Bcl-2,Bad mRNA level by realtime fluorescence quantitative RT-PCR.[Results]Compared with the controlgroup,the apoptosis rate of PESV treated K562 cellswas significantly increaseds,the expression of PI3K and p-Aktand anti-apoptosis-related gene Bcl-2mRNA was decreased;the expression of proapoptotic gene BadmRNAwas increased.[Conclusion]PESVmay regulate the expression of Bcl-2 and Bad,inhibit the proliferation of K562 cellsand promote theirapoptosisby reducing the expression of PI3K and Aktsignaling protein.

PESV;K562 cell lines;apoptosis;PI3K;Akt;Bcl-2;Bad

R733.72

A

1672-1519（2012）03-0274-04

教育部博士點基金項目（20091210110004）。

張 蕾（1978-），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合血液病臨床和科研。

楊文華。

2012-02-28）