實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠大血管病變TGF-β1和CTGF的表達(dá)及中藥的干預(yù)作用*

王 軍，徐 陽，袁向科，張學(xué)勇，丁志明

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠大血管病變TGF-β1和CTGF的表達(dá)及中藥的干預(yù)作用*

王 軍，徐 陽，袁向科，張學(xué)勇，丁志明

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]通過觀測實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠大血管病變中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）和結(jié)締組織生長因子（CTGF）相關(guān)表達(dá)，揭示糖尿病大血管病變的發(fā)病機(jī)制。并通過中藥干預(yù)的觀察，明確中藥在預(yù)防和治療糖尿病大血管病變的靶點(diǎn)。[方法]雄性SD大鼠80只，其中正常對照組10只，70只造糖尿病模型并隨機(jī)分為5組：模型組（n=14），中藥高、中、低劑量組（n=14），二甲雙胍組（n=14）。6組大鼠均予普通飼料加干預(yù)喂養(yǎng)12周后，取股動(dòng)脈，應(yīng)用免疫組化法觀察糖尿?。―M）大鼠大血管中CTGF、TGF-β1表達(dá)的部位及其變化。[結(jié)果]TGF-β1主要在胞漿中表達(dá)。模型組TGF-β1表達(dá)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，中藥干預(yù)組TGF-β1表達(dá)明顯下降（P＜0.01），二甲雙胍對TGF-β1表達(dá)有影響，但與中藥高劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C TGF在模型組血管管壁下層細(xì)胞漿可見大量棕黃色物質(zhì)表達(dá)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，各藥物干預(yù)組血管細(xì)胞CTGF表達(dá)都明顯下降（P＜0.01），中藥高劑量組與西藥對照組表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)論]1）糖尿病大血管病變可能與纖維化有關(guān)。2）中藥組方加味桃核承氣湯能有效降低致纖維化因子TGF-β1、CTGF在實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠大血管病變中的表達(dá)。其對DM大血管病變有改善作用，并存在劑量依賴關(guān)系。

2型糖尿?。淮笱懿∽?；纖維化；中藥；結(jié)締組織生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；免疫組化

大血管病變是糖尿病（DM）常見的并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致殘和致死的最主要原因之一。糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說，目前公認(rèn)的主要有糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）學(xué)說和氧化應(yīng)激等學(xué)說。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)：糖尿病患者截肢標(biāo)本中，血管病變是以內(nèi)膜的纖維性增厚為主，僅有極少部分患者出現(xiàn)粥樣硬化斑塊，而且脂質(zhì)沉積特點(diǎn)與單純動(dòng)脈粥樣硬化并不相同，纖維成分所占比例大，在電鏡下也看到同樣的結(jié)果。既往現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于糖尿病大血管并發(fā)癥研究和治療都是基于動(dòng)脈粥樣硬化角度的，對于其纖維化病變都未予重視，認(rèn)為有可能從膠原纖維沉積的角度突破，以便更好的揭示糖尿病動(dòng)脈損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠80只，清潔級，2月齡，體質(zhì)量200～250 g，由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味桃核承氣湯（桃仁10 g，大黃 6 g，桂枝 6 g，甘草 3 g，芒硝 6 g，黃芪 30 g，生地15 g，麥門冬12 g，玄參12 g），減壓濃縮至濃度為0.76 g/mL，大鼠用藥劑量為生藥6.07 g/（kg·d）。由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽酸二甲雙胍片：0.25 g/片，100片/瓶，天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，藥品研碎與生理鹽水配成0.1%的溶液。成人推薦劑量為1.5 g/70（kg·d），大鼠相當(dāng)于人的等效劑量為0.14 g/（kg·d）。

生理鹽水：天津大冢制藥有限公司生產(chǎn)。

精蛋白鋅胰島素注射液：400U/瓶。由江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 血糖儀：德國羅氏活力型血糖儀。顯微鏡：日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11。多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司Image-ProPlus。切片機(jī)：德國萊卡RM2015。離心機(jī)：北京離心機(jī)廠LDZ5-2型。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 SP免疫組化試劑盒：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型DAB顯色劑試劑盒：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多聚賴氨酸：美國SANTA CRUZ公司。兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）多克隆抗體：美國 SANTA CRUZ公司。枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）：由天津市南開醫(yī)院病理室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 正常對照組（n=10，A組），造模成功的70只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組：糖尿病模型組（n=14，B組），糖尿病+加味桃核承氣湯高劑量治療組（n=14，C組），糖尿病+加味桃核承氣湯中劑量治療組（n=14，D組），糖尿病+加味桃核承氣湯低劑量治療組（n=14，E組），糖尿病+二甲雙胍治療組（n=14，F(xiàn)組）。大鼠非禁食狀態(tài)下血糖維持在25mmol/L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 5組大鼠全部予普通飼料喂養(yǎng)，每日給予適量長效胰島素皮下注射，前5周每周2次尾靜脈取血測血糖，后7周每周1～2次監(jiān)測血糖，B、C、D、E、F 組維持非禁食狀態(tài)血糖 25mmol/L。

同時(shí)，A組和B組給予0.9%生理鹽水10mL/kg灌胃，每日 1次，C、D、E 組按 10、7.5、5mL/kg給予中藥灌胃，每日1次，F(xiàn)組以二甲雙胍0.14 g/（kg·d）溶于10mL生理鹽水中灌胃。

1.3 檢測分析

1.3.1 觀察指標(biāo) TGF-β1、結(jié)締組織生長因子（CTGF）。

1.3.2 取材 按照上述方法飼養(yǎng)大鼠12周后，禁食24 h后，用10%的水合氯醛3 g/k g，麻醉，仰臥位固定大鼠,備皮、消毒、鋪巾。沿股動(dòng)脈走向縱向切開皮膚,用蚊式鉗鈍性分離組織，以暴露股動(dòng)脈鞘，其中呈粉紅色且觸之有搏動(dòng)的粗大血管即為股動(dòng)脈。用眼科鑷鈍性分離截取股動(dòng)脈約4～5 cm。PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，經(jīng)70%～100%乙醇各30min共8次，二甲苯透明30min兩次沖洗，55℃石蠟中30min兩次，用銅制模具包埋組織塊；將厚度5μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜備用。

1.3.3 標(biāo)本TGF-β1免疫組化檢測 1）脫蠟、入水：將切片浸于二甲苯中5min兩次、100%～75%乙醇5 min共8次，再以自來水沖洗、PBS洗兩次。2）1%甲醇雙氧水、0.1mol/LPBS洗。3）滴加抗原修復(fù)液，0.1mol/LPBS洗。4）滴加正常山羊血清封閉液不洗。5）滴加第一抗體，4℃過夜，0.1mol/L PBS洗 3次。6）滴加生物素化第二抗體（IgG），37 ℃ 20 min，0.1mol/LPBS洗3次。7）滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃ 20min，0.1mol/L PBS洗3次。8）D AB顯色：使用DAB顯色試劑盒1mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6min，充分水洗。9）蘇木素復(fù)染細(xì)胞核中性樹脂封片。

鏡觀采相分析：以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，每張切片在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取10個(gè)視野并攝像保存，采用IMAGE PRO PLUS軟件設(shè)置陽性表達(dá)的宏程序，在同一條件下，分析不同組別的TGF-β1含量，對陽性表達(dá)率進(jìn)行組間比較。

1.3.4 標(biāo)本CTGF免疫組化檢測 所用載玻片均經(jīng)多聚賴氨酸處理，連續(xù)切片厚4μm，一抗為兔抗CTGF和兔抗TGF-β1多克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG，以0.01mol/LPBS代替一抗作陰性對照。具體步驟如下：1）石蠟切片厚4μm，常規(guī)脫蠟，置于3%過氧化氫甲醇溶液中，封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。2）蒸餾水沖洗，采用微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)。3）PB S洗，加入正常山羊血清，37℃，30min，封閉內(nèi)源性生物素；甩掉血清，加一抗。4）PB S沖洗，5min，3次；滴加二抗（均為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG），37 ℃，25min。5）PB S 沖洗，5min，3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（SP），37℃，20min。6）PB S 沖洗，5min，4 次。7）用新鮮配制的 DAB-H2O2液顯色，光鏡下觀察并控制顯色程度；蒸餾水沖洗，終止顯色。8）蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，光鏡觀察，陽性部位呈棕黃色。

免疫組化結(jié)果用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析3組大鼠CTGF的靜態(tài)灰度值。CTGF的表達(dá)強(qiáng)度與測得的灰度值呈負(fù)相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程順利，各組死亡大鼠：A組1只、B組1只、C組5只、D組3只、E組3只、F組2只。故至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量為：A組（n=9）、B 組（n=13）、C 組（n=9）、D 組（n=11）、E 組（n=11）、F組（n=12）。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如下。

2.1 各組大鼠血糖比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各糖尿病大鼠（B、C、D、E、F 組）血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組股動(dòng)脈TGF-β1、CTGF表達(dá)水平 見表1。與正常對照組比較，糖尿病模型組CTGF、TGF-β1均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與正常對照組比較各治療組，CTGF、TGF-β1均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各中藥治療組與糖尿病模型組比較，CTGF、TGF-β1均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖尿病模型組比較，西藥組 CTGF、TGF-β1 均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與西藥組比較中藥高劑量組，CTGF、TGF－β1均有降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠股動(dòng)脈中CTGF、TGF-β1的表達(dá)水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

表1 各組大鼠股動(dòng)脈中CTGF、TGF-β1的表達(dá)水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 n CTGF TGF-β1正常對照組 9 1.45±0.16 12.47±2.83 DM 模型組 13 6.11±0.67** 43.25±3.16**加味方高劑量組 9 2.86±0.30*▲▲ 16.42±1.68*▲▲加味方中劑量組 11 3.14±0.12*▲ 24.74±2.53*▲加味方低劑量組 11 3.62±0.21*▲ 31.86±4.39*▲二甲雙胍治療組 12 3.29±0.30*▲ 28.75±4.55*▲

2.3 各組大鼠免疫組化圖像觀察及分析 CTGF：正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；模型組血管黏膜下層細(xì)胞漿可見大量棕黃色物質(zhì)表達(dá)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，治療組血管細(xì)胞CTGF表達(dá)都明顯下降（P＜0.01），其中，中藥高劑量組與西藥對照組表達(dá)有差別，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TGF-β1：TGF-β1主要在胞漿中表達(dá)。正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；模型組TGF-β1表達(dá)明顯多的棕黃色顆粒物質(zhì)，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，治療后，與造模組比較，中藥組TGF-β1表達(dá)明顯下降（P＜0.01），二甲雙胍對 TGF-β1表達(dá)有影響，與中藥中劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與中藥高劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

血管壁纖維化，作為糖尿病的主要并發(fā)癥，表現(xiàn)在過量的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積導(dǎo)致血管管腔直徑的縮小及動(dòng)脈壁的增厚。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管纖維化中起著重要作用，并與CTGF有著密切聯(lián)系。

TGF-β對于基質(zhì)蛋白聚集和膠原纖維沉積具有重要調(diào)節(jié)作用，TGF-β在細(xì)胞外基質(zhì)沉積過程中在減少基質(zhì)降解酶及增加降解抑制劑合成的同時(shí)，還促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，在多種組織器官纖維化發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1]。近年來，越來越多的研究已經(jīng)提出以TGF-β1為靶目標(biāo)抗纖維化。通過消除纖維化發(fā)展過程中病變組織產(chǎn)生的過多TGF-β1來預(yù)防或阻斷纖維化的發(fā)展已成為纖維化防治研究的最新熱點(diǎn)[2]。結(jié)締組織生長因子是一種屬于CCN家族的生長因子，是與組織纖維化密切相關(guān)的促纖維化細(xì)胞因子。正常生理情況下，其在維持正常細(xì)胞和結(jié)締組織功能中具有至關(guān)重要的作用，它還在一些疾病引起的組織損傷修復(fù)及血管形成中起重要作用[3]。病理情況下，CTGF過度表達(dá)與某些增生性或纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。研究表明，CTGF能夠直接誘導(dǎo)結(jié)締組織細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成，是可以刺激成纖維細(xì)胞增殖和ECM沉積的生長因子[5]。CTGF生物學(xué)效應(yīng)相對單一，多在TGF－β下游起作用，能特異性介導(dǎo)TGF-β1促細(xì)胞增殖、促進(jìn)組織器官纖維化和ECM合成。CTGF是TGF-β1誘導(dǎo)組織纖維化的下游成分，CTGF啟動(dòng)子中包含了TGF-β1的反應(yīng)元件（T RE/BCE-1），TGF-β1可促進(jìn)CTGF表達(dá)上調(diào)[6]。CTGF與TGF-β共同作用能促進(jìn)慢性纖維化，許多纖維化疾病都存在TGF-β與CTGF的高表達(dá)。CTGF能有效促進(jìn)血管生成、細(xì)胞趨化及誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)生成，在多種組織細(xì)胞都有其表達(dá)，其中包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。有研究表明，CTGF可參與血管的損傷修復(fù)，可直接誘導(dǎo)結(jié)締組織細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，與血管纖維化密切相關(guān)[7]。

中醫(yī)對糖尿病血管并發(fā)癥病機(jī)的認(rèn)識，主要是本虛標(biāo)實(shí)論、從瘀論、從脾論和從肝論，最有代表性是本虛標(biāo)實(shí)論和從瘀論[8]。王憶黎[9]認(rèn)為本病的病機(jī)以標(biāo)本虛實(shí)為主線，圍繞虛、瘀、痰、毒4個(gè)環(huán)節(jié)。本虛主要有脾氣虛、腎陰不足、脾腎兩虛、甚至陰陽兩虛，而瘀、痰、毒則是構(gòu)成標(biāo)實(shí)的基本要素。吳深濤[10]認(rèn)為消渴病與其并發(fā)癥實(shí)質(zhì)上是由虛致實(shí)，又因?qū)嵵绿摰南鄬Φ囊蚬P(guān)系。但大多認(rèn)為本病氣陰兩虛為本，痰濁瘀血為標(biāo)，互為因果惡性循環(huán)，致使糖尿病血管病變進(jìn)行性發(fā)展加重。因此益氣養(yǎng)陰、活血化瘀是治療糖尿病血管并發(fā)癥的常用大法。用于瘀熱互結(jié)的經(jīng)方桃核承氣湯伍以益氣養(yǎng)陰藥而成的加味桃核承氣湯既往有研究表明在防治糖尿病血管并發(fā)癥上有很好的作用[11]。通過本研究證實(shí)其能有效降低致纖維化因子TGF-β1、CTGF在實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠大血管病變中的表達(dá)，其對DM大血管病變有改善作用，并存在劑量依賴關(guān)系。這為今后的研究以及防治糖尿病血管病變提供一條新途徑。

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Expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy and intervention role of traditionalChinesemedicine

WANG Jun,XUYang,YUANXiang-ke,ZHANGXue-yong,DINGZhi-ming
（Th e FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chi na）

[Objective]To explore the pathogenesismechanism ofmacroangiopathy in diabetic patients trough observing the expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimental diabeticmacroangiopathy and decide the target in preventing and treating themacroangiopathy in patientswith diabetes through observing the preventing effectof TCM.[Methods]Among eightymale SD rats seventywere induced with diabetes(DM).They were divided into 5 groups:model group(n=14),high,medium and low dose of traditional Chinese medicine groups(n=14),melbine group(n=14).All rats in these six groupswere givingwith ordinary feed for12 weeks.After that,arteria cruraliswasobtained and the site and change ofexpression ofCTGFand TGF-β1 in which were observed.[Results]TGF-β1wasmainly expressed in the cytoplasm.It is strong positive inmodelgroup.In Chinesemedicine intervention groups the expression of TGF-β1 was declined obviously(P<0.01).Melbine has influence on the expression of TGF-β1,but the comparison with high dose of traditional Chinesemedicine group has significantdifference(P<0.05).A large ofbrown-1yellowmaterialwith strong positive reaction(CTGF)could be seen in cytochylema in submucosa ofblood vesselsofmodelgroup.But the CTGFexpressionwasallsignificantly lowered in cellofblood vessels in drug intervention groups(P<0.01).The difference ofexpression between high dose group and Westernmedicine controlgroup was statistically different.[Conclusion]1）The onsetofdiabetic angiopathymay be concerned with fibrosis.2）Modified Taohe Chengqi Decoction can reduce the expression of Fibrosis factor TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy.Itcan improvemacroangiopathy in DM and hasa dose-1dependent relationship.

diabetesmellitus 2macroangiopathy;macroangiopathy fibrosis;traditionalChinesemedicine;CTGF;TGF-β1;immunohistochemistry

R587.2

A

1672-1519（2012）03-0266-04

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（09JCYBJC12500）。

王 軍（1962-），女，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事中醫(yī)糖尿病足與周圍血管病相關(guān)研究工作。

2012-04-22）