周期性機(jī)械拉伸對兔角膜成纖維細(xì)胞MMP-2／TIMP-2及TGF－β1表達(dá)的影響

王曉君，陳維毅，李曉娜，馮鵬飛，高志鵬

（太原理工大學(xué)a.力學(xué)學(xué)院；b.應(yīng)用力學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程研究所，太原030024）

力學(xué)環(huán)境是生命體內(nèi)的一種自然生存環(huán)境，也是一個(gè)非常復(fù)雜的環(huán)境，目前對細(xì)胞力學(xué)的研究大都是通過體外模擬實(shí)驗(yàn)來完成的。應(yīng)力刺激是細(xì)胞代謝的重要調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理功能如基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮著重要作用［1－2］。應(yīng)力刺激的大小、頻率、時(shí)間及加載形式等對細(xì)胞功能的影響不同。周期性的應(yīng)力刺激比持續(xù)性的應(yīng)力刺激更能促進(jìn)細(xì)胞增殖和基因表達(dá)［3］。

角膜成纖維細(xì)胞位于基質(zhì)板層中，胞漿中富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。胚胎時(shí)期是由顱神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移衍生形成的間充質(zhì)細(xì)胞，在遷移完成后，胚胎角膜基質(zhì)細(xì)胞開始合成和分泌Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ型膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分［4］。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）中最豐富的結(jié)構(gòu)成分，也是角膜中承受力的主要部分。正常狀態(tài)下，角膜基質(zhì)細(xì)胞可合成分泌 MMPs，同時(shí)也分泌 TIMPs及 TGF-β1。MMPs是一種重要的膠原降解酶，幾乎能降解ECM 的所有成分［5－6］，MMPs表達(dá)增高，可引起膠原的降解增多。TIMPs在多個(gè)環(huán)節(jié)抑制MMPs的活性，亦有可抑制新生血管形成的作用，二者保持動態(tài)平衡，調(diào)節(jié) ECM 的穩(wěn)定［7－8］。MMP-2和 TIMP-2的表達(dá)受激素、生長因子、細(xì)胞因子、原癌基因等的調(diào)控，在這些因子中TGF－β1是被廣泛關(guān)注并研究的一個(gè)［9］。受到力學(xué)刺激或創(chuàng)傷后，角膜經(jīng)歷了ECM的合成、降解、再合成的動態(tài)修復(fù)過程。MMPs與TIMPs的平衡和相互影響決定著ECM的降解，在眼部的傷口愈合、血管生成增殖性病變及組織纖維化等許多病理過程中起重要作用［10－12］。TGF-βl是一個(gè)具有多功能的雙重調(diào)節(jié)劑生長因子，其主要的生物學(xué)功能之一就是促進(jìn)ECM表達(dá)和抑制ECM的降解。而這一效應(yīng)又主要是通過調(diào)節(jié)MMP-2和 TIMP-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的［13］。

角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞主要分泌MMP-2，MMP-2具有監(jiān)督正常角膜功能的作用，催化降解偶爾受損的角膜膠原，角膜受損后該酶主要參與角膜基質(zhì)膠原的重建過程，以便恢復(fù)角膜組織功能［14］。本文對正常兔角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行幅度分別為5%、10%及15%的周期性機(jī)械拉伸，并于拉伸后6h、24 h取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清，采用ELISA檢測MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的含量，研究力學(xué)刺激對角膜成纖維細(xì)胞外基質(zhì)中 MMP-2、TIMP-2及TGF-β1表達(dá)的影響，探討力學(xué)因素在LASIK術(shù)后角膜修復(fù)中的作用。

1 方法和材料

1.1 兔角膜成纖維細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法培養(yǎng)兔角膜成纖維細(xì)胞。正常兔角膜基質(zhì)中成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，并且呈散在、靜止?fàn)顟B(tài)。為了獲得足夠的兔角膜成纖維細(xì)胞，一次選取成年3只新西蘭大白兔的6個(gè)角膜進(jìn)行原代培養(yǎng)，同時(shí)取材時(shí)沿角鞏膜緣內(nèi)1mm剪取角膜組織，并在顯微鏡下徹底清除上皮層和內(nèi)皮層，以確保原代細(xì)胞培養(yǎng)的單一性。

將消化培養(yǎng)法獲得的兔角膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，約2d后，即可見成纖維細(xì)胞開始貼壁生長，1周左右匯合。倒置相差顯微鏡下觀察，可見兔角膜成纖維細(xì)胞呈梭形，單層、渦旋狀生長。細(xì)胞傳代爬片后，采用波形蛋白（武漢博士德）對角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)染色鑒定，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)提取的細(xì)胞為角膜成纖維細(xì)胞［2］。

1.2 兔角膜成纖維細(xì)胞周期性拉伸實(shí)驗(yàn)

Flexcell4000柔性基底拉伸加載系統(tǒng)裝置屬于張應(yīng)力系統(tǒng)加力裝置，可對群體細(xì)胞施加不同力學(xué)刺激參數(shù)的加載程序。該系統(tǒng)用真空泵對培養(yǎng)的細(xì)胞施加動態(tài)循環(huán)負(fù)壓，使BioFlex培養(yǎng)板基底膜變形，從而使生長在膜上的貼壁細(xì)胞也發(fā)生相應(yīng)的變形，誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)變化。加載過程在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。

采用本實(shí)驗(yàn)室提取的培養(yǎng)至2－3代的角膜成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex六孔培養(yǎng)板上，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。待細(xì)胞80%融合時(shí)，換成含2%的胎牛血清，選擇加載參數(shù)，進(jìn)行力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用頻率為0.1Hz的正弦波分別對兔角膜成纖維細(xì)胞實(shí)施不同拉伸幅度及加載時(shí)間的力學(xué)刺激。

加載程式1：牽拉幅度5%；加載時(shí)間6h、24h。

加載程式2：牽拉幅度10%；加載時(shí)間6h、24h。

加載程式3：牽拉幅度15%；加載時(shí)間6h、24h。

每個(gè)加載程式均設(shè)1組靜態(tài)對照，細(xì)胞代數(shù)、培養(yǎng)條件和接種密度與加載組完全相同。拉伸后對細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞活性在95%以上。卸載后分別收集每孔的培養(yǎng)液，4℃、3 000r／min離心20 min后取上清。－20℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.3 ELISA檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測不同拉伸幅度、周期性拉伸不同時(shí)間后細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2、TIMP-2 及 TGF－β1 的含量。主要試劑有：兔 MMP-2ELISA 試 劑 盒 （RapidBio Lab，USA），兔 TIMP-2ELISA 試劑盒（RapidBio Lab，USA），TGF-β1ELISA 試 劑 盒 （RapidBio Lab，USA），MMP-2 一 抗 （武 漢博 士 德 進(jìn) 口 分 裝），TIMP-2一抗（武漢博士德進(jìn)口分裝）及TGF－β1一抗（武漢博士德進(jìn)口分裝）。操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。采用ELX800酶標(biāo)儀（Bio-Tek，USA）于450 nm處讀取OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測樣本MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±SD）表示，并采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，認(rèn)為p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 周期性機(jī)械拉伸對MMP-2表達(dá)的影響

拉伸后角膜成纖維細(xì)胞MMP-2表達(dá)結(jié)果如表1所示。

表1 不同拉伸幅度、不同拉伸時(shí)間下MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的含量

當(dāng)拉伸幅度為5%時(shí)，MMP-2的表達(dá)同對照組相比，無論拉伸6h還是24h，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。當(dāng)拉伸幅度為10%和15%時(shí)，拉伸6h同對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），而拉伸24h同對照組相比顯著性升高（p＜0.05）。

為了觀察相同拉伸時(shí)間時(shí)不同拉伸幅度對MMP-2的表達(dá)的影響，分別將不同拉伸幅度的對照組看作1，計(jì)算拉伸6h、24h后 MMP-2表達(dá)的相對改變量，如圖1所示。無論是拉伸6h還是24h，MMP-2的相對含量隨拉伸幅度的增大而增加，拉伸24h后，增加幅度更加明顯。

圖1 不同拉伸幅度、不同拉伸時(shí)間對MMP－2表達(dá)的影響（＊拉伸組與自身對照組相比，p＜0.05）

2.2 周期性機(jī)械拉伸對TIMP-2表達(dá)的影響

周期性拉伸后角膜成纖維細(xì)胞TIMP-2表達(dá)結(jié)果見表1。當(dāng)拉伸幅度為5%和10%時(shí)，無論周期性拉伸6h還是24h，TIMP-2的表達(dá)同對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。當(dāng)拉伸幅度為15%時(shí)，周期性拉伸6h同對照組相比仍然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），而拉伸24h同對照組相比顯著下降（p＜0.05）。

圖2 不同拉伸幅度、不同拉伸時(shí)間對TIMP-2表達(dá)的影響（＊拉伸組與自身對照組相比，p＜0.05）

同樣，為了觀察相同拉伸時(shí)間、不同拉伸幅度對TIMP-2的表達(dá)的影響，也進(jìn)行歸一化處理，分別計(jì)算周期性拉伸6h、24h后TIMP-2表達(dá)的相對改變量，對照比較見圖2。拉伸6h后，TIMP-2的相對含量同對照組相比均有所降低，24h后TIMP-2的相對含量隨拉伸幅度的增大而降低。

2.3 周期性機(jī)械拉伸對TGF-β1表達(dá)的影響

拉伸后角膜成纖維細(xì)胞TGF－β1表達(dá)結(jié)果見表1。當(dāng)拉伸幅度為5%和10%時(shí)，無論周期性拉伸6 h還是24h，TGF-β1表達(dá)同對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。當(dāng)拉伸幅度為15%時(shí)，拉伸6h同對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），而拉伸24 h同對照組相比顯著性升高（p＜0.05）。

圖3為不同拉伸幅度、不同拉伸時(shí)間對TGF－β1表達(dá)的影響。

同樣，為了觀察相同拉伸時(shí)間、不同拉伸幅度對TGF-β1的表達(dá)的影響，也進(jìn)行歸一化處理，分別計(jì)算周期性拉伸6h、24h后TGF－β1表達(dá)的相對改變量，對照比較見圖3。拉伸24h后，拉伸幅度為15%時(shí)，TGF-β1的相對含量增加。

圖3 不同拉伸幅度、不同拉伸時(shí)間對TGF-β1表達(dá)的影響（＊拉伸組與自身對照組相比，p＜0.05）

3 討論

準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)（laser in situ keratomileusis，LASIK）是目前開展廣泛且臨床療效明確的治療近視的角膜屈光手術(shù)，但是近年來臨床上術(shù)后繼發(fā)性圓錐角膜的病例也屢有報(bào)道［15－16］。力學(xué)環(huán)境的改變對LASIK術(shù)后圓錐角膜病變的發(fā)展是一個(gè)不可忽視的因素，術(shù)后角膜層變薄，角膜拮抗膨脹壓的能力也隨之降低，使受損部位的組織受到更大的牽拉。角膜組織中的角膜成纖維細(xì)胞能夠感受外來機(jī)械應(yīng)力刺激，并對此作出響應(yīng)，從而影響其生長、增殖、凋亡及其分泌的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分。

正常角膜中MMP多以無活性的酶原形式存在。當(dāng)受到力學(xué)、化學(xué)及各種病理浸潤后，MMP被激活，基質(zhì)降解增加、組織破壞；同時(shí)ECM成分合成增加，對角膜進(jìn)行修復(fù)。如果MMP的活化調(diào)節(jié)失控，角膜即發(fā)生溶解潰瘍或瘢痕形成。LASIK術(shù)后角膜上皮受損，基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生增殖，分泌MMPs，使基質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并進(jìn)行基質(zhì)重塑［17］。角膜受損后出現(xiàn)的炎性反應(yīng)，能引起角膜基質(zhì)的分解酶活性增加，導(dǎo)致角膜融解、變薄，從而導(dǎo)致繼發(fā)性圓錐角膜［18］。LASIK術(shù)在改變角膜在體內(nèi)力學(xué)環(huán)境的同時(shí)，也使角膜受到不同程度的損傷，很難界定哪些改變是由單純力學(xué)環(huán)境改變而引起的。

研究表明，體外力學(xué)因素能夠影響 MMP-2、TIMP-2及TGF－β1的表達(dá)。過度拉伸可以直接上調(diào)肌腱成纖維細(xì)胞MMP-2的表達(dá)和活性，而對其抑制劑TIMP-2卻沒有顯著影響［19］。對牛小梁細(xì)胞周期性拉伸72h后，與對照組相比 MMP-2與TIMP-1含量明顯增加，而 TIMP-2和 MMP-9的水平不受影響［20］。對人鞏膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行拉伸幅度為15%的48h周期性拉伸后，鞏膜成纖維細(xì)胞分泌的ProMMP-2表達(dá)顯著增加，TIMP-2表達(dá)顯著降低，從而增加了MMP-2的活性，有助于降解鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)，使眼鞏膜變薄進(jìn)而導(dǎo)致眼球膨脹［3］。TGF-β1含量增高，可導(dǎo)致 MMP-2的分泌作用增強(qiáng)，如在人絨癌細(xì)胞中及在人腹膜間皮細(xì)胞中檢測到 TGF－β1能刺激 MMP-2表達(dá)增強(qiáng)［13］。

本文結(jié)果表明，15%幅度的周期性拉伸24h后，角膜成纖維細(xì)胞分泌TIMP-2減少，對 MMP－2抑制作用減弱，同時(shí)TGF－β1表達(dá)增高，刺激 MMP－2表達(dá)升高，這均與 MMP-2表達(dá)的變化具有一致性。說明角膜成纖維細(xì)胞在體外以一定幅度周期性拉伸一定時(shí)間后，細(xì)胞分泌的 MMP-2、TIMP-2及TGF-β1才會發(fā)生顯著改變，三者相互作用，共同調(diào)節(jié)角膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為。這提示在一定強(qiáng)度的力學(xué)刺激下，角膜細(xì)胞外基質(zhì)膠原酶的數(shù)量或活性增高，膠原酶抑制劑的水平降低均可使細(xì)胞外膠原成分及代謝發(fā)生變化。因此，建立不同切削量的LASIK術(shù)動物模型，檢測術(shù)后不同時(shí)期角膜組織中MMP-2、TIMP-2的含量及角膜組織力學(xué)性能的改變，從生物力學(xué)角度探討手術(shù)引起的繼發(fā)性圓錐角膜的成因十分必要。

體外力學(xué)拉伸雖然可以直接闡明力學(xué)刺激對MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1表達(dá)的影響，但在角膜生理、病理和手術(shù)過程中，損傷導(dǎo)致的炎性因子和細(xì)胞因子的釋放，會對 MMP-2、TIMP-2及TGF－β1表達(dá)產(chǎn)生影響，并可能與力學(xué)刺激產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。角膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種調(diào)節(jié)因子之間存在著復(fù)雜而精確的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，以適應(yīng)角膜發(fā)育、組織塑型、損傷修復(fù)等動態(tài)平衡的需要，目前這類復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制還不明了，尚待進(jìn)一步研究。

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