植物Na＋/H＋逆向轉運蛋白研究進展

杜利霞，董寬虎，朱慧森

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801）

Na＋/H＋逆向轉運蛋白是細菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉運蛋白，參與細胞質內(nèi)的pH、Na＋濃度調(diào)節(jié)及細胞體積變化等生命活動［1，2］。在 GenBank中已經(jīng)注冊的Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因序列已經(jīng)達到400多個，氨基酸序列達236個［3］。近年來，Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因以及該基因表達活性的調(diào)節(jié)機制，蛋白的結構功能等的研究受到學術界的廣泛關注，特別是隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該蛋白在植物耐鹽性方面起重要作用。僅從Na＋/H＋逆向轉運蛋白的結構特點、生理功能及其與植物耐鹽性關系方面的研究進展進行論述。

1 Na＋/H＋逆向轉運蛋白的分類

1.1 質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白

植物Na＋/H＋逆向轉運蛋白活性首次在大麥中發(fā)現(xiàn)［4］，并定位于質膜，質膜 Na＋/H＋逆向轉運蛋白主要與植物對Na＋的外排有關，是植物抗拒鹽離子毒害的首個屏障。

在酵母中首次克隆了質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因（SOS1）［5］。植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因是Shi等［6］2000年首次從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆到，植物中的SOS1定位于葉和根的質膜上，分子量為127kDa。在SOS1和其他質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白氨基酸序列中，均存在一個非常保守的Na＋結合區(qū)，沒有發(fā)現(xiàn)氨氯吡咪（Na＋通道阻斷物）結合位點［7，8］。其 N末端為一個疏水結構，可能由10～12個跨膜結構域組成，跨膜區(qū)和微生物、動物的Na＋/H＋逆向轉運蛋白序列類似，SOS1序列另一個特征是它有個長的親水尾部，將近700個氨基酸，尾部面向細胞質，就有更多機會跟那些調(diào)控逆向轉運蛋白活性的諸多蛋白相互作用，以此達到調(diào)節(jié)Na＋/H＋運輸，適應鹽環(huán)境的目的［7，8］。Shi等［6］利用圖位克隆策略克隆到的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白SOS1基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因位于擬南芥的第2染色體上，具有22個內(nèi)含子和23個外顯子，編碼1 146個氨基酸。

已經(jīng)克隆的植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因（表1）。在克隆質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因過程中，研究者發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)高等植物的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白均有單基因編碼［10，11］。目前僅在海草（Cymodocea nodosa）［12］和昆諾阿藜（Chenopodium quinoa）［7］中分別克隆到2個編碼質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白的基因。可見，大多數(shù)植物的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白可能是一個單基因家族。

1.2 液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白

液泡膜Na＋/H＋逆向轉運活性首次被發(fā)現(xiàn)是在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上［13］，之后，許多具有液泡膜Na＋/H＋交換活性的植物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Nass等［14］在篩選酵母cnb1突變體的抑制子時，發(fā)現(xiàn)了1個與耐鹽性有關的新基因NHX1，它編碼Na＋/H＋逆向轉運蛋白，定位于液泡膜上負責將Na＋區(qū)隔化入液泡。將Na＋的區(qū)隔化入液泡，是酵母及植物降低細胞質內(nèi)Na＋水平的另一途徑，一方面減少了Na＋在細胞質內(nèi)對細胞器的毒害作用，另一方面也降低了植物細胞的滲透勢，有利于植物在高鹽低滲的環(huán)境下吸收水分，維持植物的生長。

表1 克隆的植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因Table 1 The plasma membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

Sardet等［15］完成了第1個液泡膜 Na＋/H＋逆向轉運蛋白（NHE）的分子克隆，其氨基酸序列的親水性圖譜顯示Na＋/H＋逆向轉運蛋白的N末端結構域是由大約500個氨基酸形成的12個跨膜片段組成，這一區(qū)域對Na＋/H＋逆向轉運蛋白的底物、Na＋的競爭性抑制劑氨氯吡咪及其衍生物敏感，是負責轉運的區(qū)域；與之相連的C末端結構域由大約300個氨基酸組成，位于細胞質一側，此結構域內(nèi)含有多個蛋白激酶作用位點，能夠與鈣調(diào)素結合，參與多種信號反應，是調(diào)節(jié)活性的區(qū)域。酵母液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白（NHX1）與NHE家族類似，也是內(nèi)在蛋白，N末端結構域含有12個跨膜的片段，由633個氨基酸組成［14］。擬南芥的Na＋/H＋逆向轉運蛋白（AtNHX）與酵母的NHX1以及人的NHE6結構相似，由538個氨基酸組成［16］。擬南芥液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白可以分為9個跨膜結構域和一個親水C端結構域；跨膜區(qū)為疏水，呈螺旋狀，含有Na＋結合的重要殘基。這些區(qū)域含有陽離子運輸?shù)慕Y構，其中的3個疏水區(qū)為非跨膜結構，而與液泡膜顯示出一定的關聯(lián)。其N端處于細胞質中，而幾乎整個的C端親水區(qū)處于液泡膜內(nèi)［17］。

表2 已克隆的一些植物液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因Table 2 The tonoplast membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

2 Na＋/H＋逆向轉運蛋白的功能

2.1 Na＋的外排

Na＋從土壤向根中的單向運輸有一個重要特點，就是高速。盡管Na＋的內(nèi)流速率很高，但根部并沒有快速積累Na＋。而且在鹽漬環(huán)境中，隨時間的延長，根部的Na＋含量變化不大，但地上部分的Na＋含量卻趨向于升高，但速度很慢，這暗示穿過質膜的Na＋外流量很大［18］。Na＋外排是避免Na＋在細胞質中積累的一種直接途徑。植物將Na＋排出細胞外時需逆著電化學勢梯度，是一個主動運輸過程。在高等植物中，Na＋的外排是通過質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白實現(xiàn)，且質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白的基因是高等植物中唯一具備將Na＋排到細胞外功能的離子平衡調(diào)節(jié)基因［19］。質膜 H＋－ATPase（P－ATPase）用水解ATP產(chǎn)生的能量將H＋從細胞質中泵出細胞，產(chǎn)生跨質膜的 H＋電化學勢梯度，提供能量，從而驅動質膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白，使H＋順其電化學勢進入細胞，Na＋則逆電化學勢排出細胞［20］。這一點已經(jīng)得到Vitart等的證實［21］。

2.2 Na＋區(qū)隔化

無論是鹽生植物還是非鹽生植物的細胞質中酶對Na＋都非常敏感。為了保持胞質內(nèi)Na＋的非毒性水平，植物細胞除了將胞質中的Na＋排出細胞以外，另一個途徑就是將細胞質中的Na＋區(qū)隔化入液泡。Na＋區(qū)隔化至液泡中后，一方面降低了胞質中的Na＋濃度，避免胞質中過高Na＋對生理生化代謝的干擾；另一方面還可降低植物細胞水勢，促進植物從外界吸水，從而有利于植物在鹽漬化土壤上的生存。Na＋進入液泡是通過液泡膜上的 Na＋/H＋逆向轉運體完成［22，23］。液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白行使功能需要依賴于液泡膜上的H＋－PPase和H＋－ATPase所產(chǎn)生的跨膜質子電化學勢梯度為驅動力，將胞質Na＋區(qū)隔化入液泡中。這意味著通過增大液泡膜質子泵基因表達來增大H＋跨膜梯度，可以為液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白介導Na＋/H＋交換提供更強大的驅動力，這樣就有可能將細胞質中過多的Na＋區(qū)隔化到液泡內(nèi)腔中，增強細胞的耐鹽性。該觀點已由Li等［24］證實，研究過量表達鹽地堿蓬 Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因SsNHX1和擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVP1的擬南芥植株比野生型擬南芥植株有更強的抗鹽能力。從而證明，鹽脅迫下液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白、H＋－PPase和 H＋－ATPase三者需要協(xié)調(diào)工作，才能最有效的將細胞質中過多的Na＋區(qū)隔化入液泡，這樣，Na＋含量可降低到無毒害水平，從而增加植株的耐鹽性。

2.3 調(diào)節(jié)pH值

SOS1外排Na＋的同時，將細胞外的H＋轉運至胞質中，使細胞質酸化，從而有利于細胞質中代謝活動的正常進行［25，26］。SOS1的 Na＋/H＋轉運活性受到抑制時（如SOS1突變），擬南芥根部H＋內(nèi)流受到抑制，細胞質發(fā)生堿化，pH值顯著升高［27］。由此可見，質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白具有調(diào)控細胞pH值的功能［28］。Na＋/H＋逆向轉運蛋白影響細胞質或細胞器pH的變化，同時也影響細胞生長對環(huán)境pH的要求。如野生型擬南芥的細胞質pH約為7.0，但chx2321突變株則為7.4，突變株在pH 4.0的環(huán)境下較pH 7.0的環(huán)境中生長良好［29］。啤酒酵母在堿性條件下，利用質膜Na＋－ATP酶將Na＋泵出胞外，但在酸性環(huán)境下則是利用Na＋/H＋逆向轉運體將Na＋排出細胞。可見，Na＋/H＋逆向轉運蛋白參與了細胞質內(nèi)pH的調(diào)節(jié)。

3 Na＋/H＋逆向轉運蛋白與耐鹽性的關系

目前酵母和高等植物的Na＋/H＋逆向轉運蛋白倍受重視，Na＋通過Na＋/H＋的逆向轉運在液泡中積累或排除細胞質外是植物耐鹽性的重要機制［30，31］，是鹽生植物和耐鹽甜土植物的主要特征［32，33］。甜土植物體內(nèi)不存在Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因，有無鹽處理都不顯示Na＋/H＋逆向轉運活性；耐鹽的甜土植物通過NaCl脅迫誘導出Na＋/H＋逆向轉運活性：如75mmol/L NaCl和150mmol/L NaCl處理向日葵，其根部液泡膜微囊上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白對Na＋的 Km 分 別 為 64mmol/L 和 8mmol/L，而Vmax不變，說明鹽處理沒有改變Na＋/H＋逆向轉運蛋白的數(shù)量，只是Na＋激活了已經(jīng)存在的Na＋/H＋逆向轉運蛋白［34］；鹽生植物Na＋/H＋逆向轉運活性是結構性的，無鹽條件下Na＋/H＋逆向轉運活性較低，鹽處理后由于Na＋/H＋逆向轉運蛋白的合成增加，其活性也增加，所以說Na＋/H＋逆向轉運蛋白的有無及其活性高低與植物的耐鹽性密切相關。

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最嚴重的非生物逆境之一，工程措施解決鹽漬化的可能性甚小，因而培育耐鹽的作物品種是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的有效途徑。對于植物耐鹽工程而言，獲得關鍵的耐鹽基因尤為重要，Na＋/H＋逆向轉運蛋白在植物抵御鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用，這類蛋白可以維持Na＋在植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，從而減輕過多的Na＋對細胞造成的毒害。隨著人們對植物耐鹽性機理的進一步了解和分子技術的提高，對該基因分離、克隆，并轉移到非抗鹽的農(nóng)作物中，對與傳統(tǒng)的育種方法結合，會得到大量的抗鹽性植物新品種改良鹽堿地，經(jīng)濟效益可觀，應用前景廣闊。

［1］Krulwich T A.Na＋/H＋antiporters［J］.Biochim Biophys Acta，1983，726：245－264.

［2］Pandan E，Schuldiner S.Intracelluler pH and membrane potential as regulator in the procaryotic cell［J］.J Membr Biol，1987，95：189－198.

［3］石樂義，李美茹，李洪清，等.植物Na＋/H＋逆向轉運蛋白功能及調(diào)控的研究進展［J］.廣西植物，2006，26（6）：602－607.

［4］Ratner A，Jacoby B.Effect of K＋its counter an ion and pH on sodium efflux from barley roots［J］.J Exp Physiol，1976，148 ：425－433.

［5］Jia Z P，Mccullough N，Martel R，et al.Gene amplication at a locus encoding aputative Na＋/H＋antiporter confers sodium and lithium tolerance in fssion yeast［J］.EMBO J，1992，11，1631－1640.

［6］Shi H Z，Ishitani M，Kim C，et al.TheArabidopsis thalianasalt tolerance gene SOS1encodes a putative Na＋/H＋antiporter［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97，6896－6901.

［7］Cosentino C，F(xiàn)ischer S E，Bertl A，et al.Na＋/H＋antiporters are differentially regulated in response to NaCl stress in leaves and roots of Mesembryanthemum crystallinum［J］.New Phytol，2010，186，669－680.

［8］Maughan P J，Turner T B，Coleman C E，et al.Characterization of salt overly sensitive 1（SOS1）gene homoeologs in quinoa（Chenopodium quinoaWilld.）［J］.Genome，2009，52，647－657.

［9］Qiu Q S，Guo Y，Dietrich M A，et al.Regulation of SOS1，aplasma membrane Na＋/H＋exchanger inArabidopsis thaliana，by SOS2and SOS3［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99，8436－8441.

［10］Martnez A J，Jiang X Y，Garciadeblas B，et al.Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice［J］.Plant Physiol，2007，143，1001－1012.

［11］Xu H X，Jiang X Y，Zhan K H，et al.Functional characterization of a wheat plasma membrane Na＋/H＋antiporter in yeast［J］.Arch Biochem Biophys，2008，473，8－15.

［12］Garciadebl S B，Haro R，Benito B.Cloning of two SOS1 transporters from the seagrassCymodocea nodosa.SOS1 transporters from Cymodocea and Arabidopsis mediate potassium uptake in bacteria［J］.Plant Mol Biol，2007，63，479－490.

［13］Blumwald E，Poole R J.Na＋/H＋antiporter in isolated tonoplast vesicles from storage tissue ofBeta vulgaris［J］.Plant Physiol，1985，78（1）：163－167.

［14］Nass R，Cunningham K W，Rao R.Intracelluar sequestrati on of sodium by a novel Na＋/H＋exchanger in yeast is enhanced by mutations in the plasma menbrance of sodium tolerance［J］.J BioChem，1997，272（42）：26145－26152.

［15］Sardet C，F(xiàn)ranchi A，Pouyssegur J，et al.Molecular cloning，primary structure and expression of the human growth factor－activable Na＋/H＋antiporter［J］.Cell，1989，56：271－280.

［16］Apse M P，Aharon G S，Snedden A，et al.Salt tolerance confered by overexpression of a vacuolar Na＋/H＋antiporter inArabidopsis［J］.Sci，1999，285：1256－1258.

［17］Yamaguchi T，Apse M P，Shi H，et al.Topological analysis of a plant vacuolar Na＋/H＋antiporter reveals a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（21）：12510－12515.

［18］Tester M，Davenport R.Na＋tolerance and Na＋transport in higher plants［J］.Ann Bot，2003，91，503－507.

［19］Blumwald E，Aharon G S，Apse M P.Sodium transport in plant cells［J］.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）－Biomembranes，2000，1465（1－2）：140－151.

［20］Rausch T，Kirsch M，Low R，et al.Salt stress responses of higher plant：the role of proton pumps and Na＋/H＋antiporters［J］.J Plant Physiol，1996，148：425－433.

［21］Vitart V，Baxter I，Doerner P，et al.Evidence for a role in growth and salt resistance of a plasma membrane H＋－ATPase in the root endodermis［J］.Plant J，2001，27，191－201.

［22］Pardo M J，Quintero F J.Plants and sodium ions：keeping company with the enerny［J］.Genome Biol，2002，3：1017－1021.

［23］Zhen R G，Kim E J，Rea P A.Acidic residues necessary for pyrophosphate－energized pumping and inhibition of the vacuolar H＋－pyrophyosphatase by N，N′－dicyclohexylcarbodiimide［J］.J Biol Chem，1997，29（272）：22340－22348.

［24］Li P，Wang Z，Zhang H，et al.Cloning and expression analysis of the B subunit of vacuolar H＋－ATPase（VHAB）in leaves of halophyteSuaeda salsaunder NaCl stress［J］.Acta Bot，Sin，2004，46（1）：93－99.

［25］包愛科，張金林，郭正剛，等.液泡膜H＋－PPase與植物耐鹽性［J］.植物生理學通訊，2006，42：777－783.

［26］Munns R，Tester M.Mechanisms of salinity tolerance［J］.Annu Rev Plant Biol，2008，59：651－681.

［27］Guo K M，Babourina O，Rengel Z.Na＋/H＋antiporter activity of the SOS1gene：lifetime imaging analysis and electrophysiological studies on Arabidopsis seedlings［J］.Physiol Plant，2009，137：155－165.

［28］馬清，包愛科，伍國強，等.質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白與植物耐鹽性［J］.植物學報，2011，46（2）：206－215.

［29］Song C P，Guo Y，Qiu Q，et al.Aprobable Na＋（K＋）/H＋exchanger on the chloroplast envelope functions in pH homeostasis and chloroplast inArabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（27）：10211－10216.

［30］Serrano R，Gaxiola R.Microbial models and salt stress tolerance in plants［J］.Crit Rev Plant Sci，1994，13：121－138.

［31］Niu X，Bressan R A.Hasegawa P M，et al.Ion homo－stasis in NaCl stress environments［J］.Plant Physiol，1995，109：735－742.

［32］Flowers T J，Troke P F，Yeo A R.The mechanisms of salt tolerance in halophytes［J］.Annu Rev Plant Physiol，1977，28：89－121.

［33］Greenway H，Munns R.Mechanisms of salt tolerant on non－h(huán)alophytes［J］.Annu Rev Plant Physiol，1980，31：149－190.

［34］Ballesterous E，Blumwald E，Donaire J P，et al.Na＋/H＋antiport activity in tonoplast vesicles isolated from sunflowers roots induced by NaCl stress［J］.Physiologia Plantarum，1997，99：328－334.