珍稀瀕危植物裸果木RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化研究

王 靜，王海芳，花立民，馬喜迎，王亮亮

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省小隴山林業(yè)實(shí)驗(yàn)局，甘肅 天水 741020）

裸果木（Gymnocarpos przewalskii）隸屬石竹科（Caryophyllaceae）裸果木屬（Gymnocarpos），主要分布在新疆南部山區(qū)、甘肅河西走廊、青海西部、內(nèi)蒙古西部、寧夏東南部（沙坡頭地區(qū)）［1］。裸果木是古地中?；哪畾堖z種，屬于珍稀植物，為1987年我國(guó)首批公布的國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，1997年被定為一級(jí)保護(hù)植物。對(duì)研究我國(guó)西北和內(nèi)蒙古荒漠的發(fā)生、發(fā)展、氣候變化及旱生植物區(qū)系成分的起源有著非常重要的科學(xué)價(jià)值［2］。近年來(lái)，由于生存環(huán)境的惡化，及自身生物學(xué)因素，又遭樵采和駱駝啃食等人類各種經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的干擾和破壞，裸果木的種群數(shù)量急劇減少，分布區(qū)已日益縮小和片段化［3］。開(kāi)展種群遺傳學(xué)研究，制定相關(guān)的保護(hù)計(jì)劃，是保護(hù)其的有效途徑。

目前有關(guān)裸果木的相關(guān)研究主要集中在形態(tài)解剖學(xué)［4，5］、生理生態(tài)［6－8］、組織培養(yǎng)和擴(kuò)繁［9］以及化學(xué)成分研究［10］等方面，有關(guān)分子水平的研究較少。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的一種分子標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)便、快速、低成本、多態(tài)性檢出率高等優(yōu)點(diǎn)［11］，在遺傳多樣性評(píng)價(jià)、物種分類與鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面有廣泛的應(yīng)用［12，13］，由于RAPD引物的隨機(jī)性及較低的退火溫度等導(dǎo)致的條件不穩(wěn)定等，影響了該技術(shù)的應(yīng)用。在應(yīng)用該技術(shù)時(shí)，通常需要對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性。為此進(jìn)行了裸果木RAPD體系的構(gòu)建和優(yōu)化試驗(yàn)，為開(kāi)展裸果木種質(zhì)資源保護(hù)和管理提供有價(jià)值的科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

自2008～2009年10月，采集了甘肅省肅北縣紅柳峽口子干溝一帶裸果木葉片若干。

成立護(hù)理質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系課題小組，護(hù)理部主任負(fù)責(zé)小組主持工作，小組成員包括3名護(hù)理質(zhì)量管理專家、2名信息工程師、3名臨床護(hù)士長(zhǎng)、3名護(hù)理骨干共11人；小組主要任務(wù)為提煉護(hù)理質(zhì)量敏感指標(biāo)、組織專家進(jìn)行指標(biāo)咨詢及篩選、構(gòu)建護(hù)理質(zhì)量控制指標(biāo)體系并嵌入護(hù)理信息系統(tǒng)、推進(jìn)以指標(biāo)監(jiān)測(cè)為主線的護(hù)理質(zhì)量控制。

試劑40個(gè)10bp大小的RAPD隨機(jī)引物、Taq酶、10×Taq緩沖液、Mg2＋、dNTP均購(gòu)自大連寶生物有限公司；瓊脂糖、DNA Marker等均購(gòu)自天為時(shí)代科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 裸果木DNA提取及濃度、純度檢測(cè) DNA提取按改良CTAB法進(jìn)行［14］。在紫外分光光度計(jì)上，檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度。

2.2.3 RAPD反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 以不同裸果木個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料，以多態(tài)性較好的引物（0～24），對(duì)建立的反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)，所選擇的引物可以擴(kuò)增出清晰、重復(fù)性好的條帶，初步表明優(yōu)化的體系及反應(yīng)參數(shù)是穩(wěn)定可靠的（圖8）。

我們黨是一個(gè)敢于堅(jiān)持真理，勇于修正錯(cuò)誤的黨。我們黨在改革開(kāi)放的過(guò)程中逐漸認(rèn)識(shí)到，要高度重視人民利益，高度重視人民生活的改善，堅(jiān)決破除一切不合時(shí)宜的思想觀念和阻礙國(guó)家民族發(fā)展的一切體制機(jī)制障礙，讓一切創(chuàng)造社會(huì)財(cái)富的源泉充分涌流。貧窮不是社會(huì)主義，人民幸福是社會(huì)主義優(yōu)越性的本質(zhì)體現(xiàn)。

Client/Server架構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)，可根據(jù)Client查詢請(qǐng)求返回相應(yīng)的結(jié)果集，避免了在網(wǎng)絡(luò)上傳播無(wú)效數(shù)據(jù)，有效地利用了網(wǎng)絡(luò)帶寬，提高了系統(tǒng)性能。本系統(tǒng)采用了流處理機(jī)制(Stream)對(duì)數(shù)據(jù)集對(duì)象(ADO)序列化和反序列化，利用AdoDataSet數(shù)據(jù)集SaveToFile方法將數(shù)據(jù)集保存到文件中，再通過(guò)內(nèi)存流(Mem?oryStream)緩存在內(nèi)存中，使用ZIP壓縮算法在壓縮內(nèi)存流中的數(shù)據(jù)后返回給Client，Client收到響應(yīng)數(shù)據(jù)后進(jìn)行反序列化即可還原出該數(shù)據(jù)集對(duì)象(ADO)。由于網(wǎng)絡(luò)上傳輸?shù)臄?shù)據(jù)是經(jīng)過(guò)壓縮的，進(jìn)一步提高了系統(tǒng)性能。

對(duì)于政府在“河長(zhǎng)制”這一政策的宣傳力度上，認(rèn)為“一般，宣傳效果只針對(duì)相關(guān)工作人員”的公眾占比半數(shù)以上，其次是“不滿意，周圍人很少關(guān)注政策內(nèi)容及實(shí)施效果”，而公眾認(rèn)為“滿意，宣傳到位且形式多樣”的占比較少，值得關(guān)注的是還有部分公眾持“對(duì)此不關(guān)注不了解”態(tài)度。因此，在“河長(zhǎng)制”宣傳工作上，還有很大的改進(jìn)空間。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的模板DNA濃度和質(zhì)量

2.2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 （1）DNA模板濃度 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0ng/μL 5個(gè)DNA模板濃度梯度。模板DNA用量為10ng時(shí)，擴(kuò)增條帶暗淡；之后，隨著模板DNA用量的增加（2.0～6.0ng/μL），條帶逐漸清晰、明亮，當(dāng)模板DNA用量4.0ng/μL時(shí)，擴(kuò)增效果最佳；其大于6.0ng/μL時(shí)，條帶數(shù)目逐漸減少。這表明模板DNA用量過(guò)少時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物太少且條帶也暗淡（圖2）。模板DNA用量較大時(shí)，由于“平臺(tái)效應(yīng)”表現(xiàn)為條帶數(shù)量逐漸減少。據(jù)此實(shí)驗(yàn)確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的DNA模板濃度為4.0ng/μL（100ng）。

圖1 DNA電泳檢結(jié)果Fig.1 The DNA electrophoretic bands extracted from leaves

2.2 RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化和程序確立

對(duì)提取的裸果木基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。DNA條帶明亮，無(wú)嚴(yán)重拖尾和降解現(xiàn)象，可見(jiàn)所提取的基因組DNA較完整，質(zhì)量較高，能應(yīng)用于RAPD反應(yīng)分析（圖1）。與λDNA的濃度梯度進(jìn)行比較，估測(cè)出DNA的濃度為100ng/μL左右。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，D260mm/D280mm比值均在1.6～1.9。

（2）Mg2＋濃度 設(shè)置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5個(gè) Mg2＋濃度梯度，設(shè)計(jì)的 Mg2＋濃度梯度均能擴(kuò)增出條帶，但Mg2＋濃度2.0mmol/L時(shí)的擴(kuò)增效果最好；當(dāng)Mg2＋濃度減少時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)目減少且亮度減弱；相反其用量增加時(shí)，擴(kuò)增的條帶也表現(xiàn)出了相同的規(guī)律。這可能及Mg2＋及激活Taq酶的活性有關(guān)系，Mg2＋濃度過(guò)低時(shí)，Taq酶的活性難以完全被激活，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低；而當(dāng)Mg2＋濃度過(guò)高時(shí)，Mg2＋會(huì)大量鰲合dNTP，從而降低了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量（圖3）。因此實(shí)驗(yàn)確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的Mg2＋濃度為2.0mmol/L。

（2）退火溫度 設(shè)定了32、34、36、38℃共4個(gè)溫度梯度。當(dāng)退火溫度較低時(shí)（32、34℃），擴(kuò)增條帶數(shù)少且模糊；36℃時(shí)擴(kuò)增的條帶最為清晰，分辨率最高；當(dāng)退火溫度高于36℃時(shí)，條帶數(shù)目減少的同時(shí)，分辨率也明顯下降（圖6）。因此實(shí)驗(yàn)確定合適的退火溫度為36℃。

（3）dNTP濃度 實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.1、0.5、0.9、1.2 mmol/L 4個(gè)dNTP濃度梯度。當(dāng)dNTP濃度小于0.5mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)目少且亮度弱；在0.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰明亮，PCR反應(yīng)充分；而當(dāng)dNTP濃度為0.9、1.2mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶分辨率下降，出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，擴(kuò)增的特異性下降（圖4）。因此實(shí)驗(yàn)確定裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的dNTP濃度為0.5mmol/L。

（4）引物濃度RAPD反應(yīng)中若引物濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致引物與模板之間的錯(cuò)配，同時(shí)還會(huì)增大引物二聚體的形成幾率；而引物濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不充分，甚至不能擴(kuò)增。RAPD反應(yīng)中，設(shè)計(jì)了0.1、0.2、0.3、0.5μmol/L等4個(gè)引物濃度梯度，0.1～1.0μmol/L均可擴(kuò)增出條帶，當(dāng)引物濃度低于0.5μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)目少而暗弱，甚至有的位點(diǎn)觀測(cè)不到；當(dāng)引物濃度在0.5μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰明亮，效果最佳，且重復(fù)性好；當(dāng)引物濃度較大時(shí)，由于非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致分辨率嚴(yán)重下降，出現(xiàn)了彌散現(xiàn)象。因此實(shí)驗(yàn)確定的裸果木多態(tài)性研究的RAPD反應(yīng)合適的引物濃度為0.3μmol/L。

2.2.2 RAPD方法擴(kuò)增程序的優(yōu)化 （1）變性時(shí)間實(shí)驗(yàn)依次設(shè)置了30、40、50s3個(gè)變性時(shí)間。隨著變性時(shí)間的延長(zhǎng)，擴(kuò)增條帶逐漸穩(wěn)定，在40s擴(kuò)增出的條帶清晰（圖6）。

大數(shù)據(jù)背景下，企業(yè)會(huì)計(jì)信息不僅完善了數(shù)據(jù)共享功能，在各企業(yè)單位的具體交流上也密切起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了企業(yè)及單位共享信息平臺(tái)建設(shè)，解決了財(cái)務(wù)信息“孤島”的問(wèn)題。同時(shí)，大數(shù)據(jù)背景下的企業(yè)會(huì)計(jì)信息化建設(shè)能提高企業(yè)的重視程度，減少中小企業(yè)會(huì)計(jì)信息化實(shí)現(xiàn)程度參差不齊的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)企業(yè)各部門、企業(yè)與企業(yè)間良好的信息共享和運(yùn)行循環(huán)。

1.2.2 RAPD－PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 PCR反應(yīng)在PE480型DNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行。參考一般反應(yīng)體系［15］，分別在25μL反應(yīng)體系中加入模板 DNA、Mg2＋、dNTP、Taq酶、引物和ddH2O。之后蓋上蓋子振蕩混勻。設(shè)置94℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，72℃延伸10min。

優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系時(shí)，固定擴(kuò)增程序，每次改變RAPD反應(yīng)中的1個(gè)參數(shù)，以確定該參數(shù)對(duì)RAPD結(jié)果的影響。篩選的參數(shù)包括：（1）模板DNA質(zhì)量濃度；（2）dNTPs濃度；（3）引物用量；（4）Mg2＋濃度。同時(shí)對(duì)擴(kuò)增程序中的退火溫度和變性時(shí)間也進(jìn)行優(yōu)化，以找到合適的反應(yīng)條件。

圖8 優(yōu)化體系下12個(gè)樣品擴(kuò)增的PCR結(jié)果（0～24）Fig.8 The PCR results of 12specimens with peimer 0～24 and optimized reaction system

最終確定的RAPD反應(yīng)為：在25μL反應(yīng)體系中，模板DNA用量為4.0ng/μL，引物濃度為0.3 μmol/L，dNTP濃度為0.5mmol/L，Mg2＋濃度為2.0 mmol/L，Taq酶用量為1U，ddH2O補(bǔ)足25μL；94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；，最后72℃延伸10min，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論

影響RAPD反應(yīng)的因素很多，任何一種因子設(shè)置不當(dāng)都會(huì)影響整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。RAPD反應(yīng)，對(duì)DNA純度要求不高，但模板DNA濃度是影響RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率與特異性的一個(gè)重要因子。模板過(guò)量，造成引物相對(duì)缺乏而抑制擴(kuò)增反應(yīng)，使生成的條帶減少而出現(xiàn)不同的指紋圖。模板濃度過(guò)低，不能發(fā)生有效的擴(kuò)增反應(yīng)或者擴(kuò)增后圖譜變異較大［16］。在PCR反應(yīng)中，Mg2＋是TaqDNA聚合酶的激活劑，太低或太高都將影響酶的活性，其濃度還影響引物與模扳的解鏈與退火。一般需將 Mg2＋濃度控制在大于2μmol/L，低于此濃度會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增條帶的穩(wěn)定性及可靠性。引物在RAPD反應(yīng)中是一關(guān)鍵因素。但RAPD擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)引物也沒(méi)有嚴(yán)格的種屬界限，引物的設(shè)計(jì)除長(zhǎng)度較短，為10個(gè)堿基左右外，其余規(guī)則與一般PCR相同。

dNTPs是PCR反應(yīng)的底物，其濃度高低會(huì)影響到擴(kuò)增產(chǎn)物的多少。濃度過(guò)低，在反應(yīng)過(guò)程中dNTPs被過(guò)早消耗完后，會(huì)減少擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量［17］；dNTPs濃度過(guò)高時(shí)，則會(huì)與TaqDNA聚合酶爭(zhēng)奪 Mg2＋，使Taq酶活性降低，不能充分發(fā)揮聚合作用而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

此外，變性時(shí)間是影響RAPD反應(yīng)最重要的因子之一。如變性時(shí)間過(guò)短，DNA模板將不能充分解鏈，引物就不能完全結(jié)合到DNA模板上，從而導(dǎo)致擴(kuò)增條帶較少；如變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)影響Taq酶活力，降低擴(kuò)增效率，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果的不穩(wěn)定和效率低等問(wèn)題［18］。故應(yīng)參考相關(guān)反應(yīng)體系，在保證條帶清晰、穩(wěn)定的條件下，選擇合適的變性時(shí)間，保證Taq酶的活性，達(dá)到擴(kuò)增的最佳效果。退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的特異性具有非常重要的作用。在RAPD反應(yīng)中，引物只有10bp，40℃以上的退火溫度會(huì)影響引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性，所以一般都低于40℃。

開(kāi)頭十二個(gè)小節(jié)的連線都沒(méi)有超過(guò)一個(gè)小節(jié)的長(zhǎng)度，但是從第13至16小節(jié)，卻用了長(zhǎng)達(dá)四小節(jié)的連線，并且還有“漸強(qiáng)”的標(biāo)記。貝多芬在這里暗示了一種更為歌唱性的句法。

研究對(duì)影響裸果木RAPD擴(kuò)增體系的一些因子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和分析，建立了一個(gè)比較穩(wěn)定的RAPD擴(kuò)增體系。但是要獲得重復(fù)性較好的結(jié)果，除了采用建立起來(lái)的最佳體系外，還應(yīng)將多個(gè)裸果木群體同時(shí)分析，將特異的標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR來(lái)進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性，以用于橫向比較，為資源的保護(hù)與利用提供依據(jù)。由于對(duì)裸果木基因組DNA進(jìn)行RAPD分析的報(bào)道極少，為了尋找適合此次實(shí)驗(yàn)的最佳RAPD反應(yīng)體系，采用單因子梯度設(shè)計(jì)分別對(duì)反應(yīng)體系中的模板DNA濃度、引物濃度、Mg2＋濃度、dNTPs濃度、變形時(shí)間及退火溫度進(jìn)行了梯度實(shí)驗(yàn)和反應(yīng)條件的優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定性較好，重復(fù)性比較高的擴(kuò)增產(chǎn)物，建立了一套適合裸果木的RAPD反應(yīng)體系，為進(jìn)一步對(duì)裸果木基因組進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，展開(kāi)裸果木的遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源保護(hù)提供了有價(jià)值的科學(xué)參考。

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