HPLC法測(cè)定跳骨片中血竭素的含量

邱曉暉劉華英黃漢偉

HPLC法測(cè)定跳骨片中血竭素的含量

邱曉暉1劉華英2黃漢偉2

目的建立HPLC法測(cè)定跳骨片中血竭素含量的方法。方法采用反相C18柱，乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉（35:45），用磷酸調(diào)PH值為3.14為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)：440nm，流速：1.0ml/min。結(jié)果血竭素進(jìn)樣量在0.13945～0.41835g范圍內(nèi)，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率為99.69%。結(jié)論采用HPLC法測(cè)定跳骨片中血竭素含量具有靈敏度好，而且準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，合理可行。

HPLC；血本竭素；含量測(cè)定

血竭是跳骨片處方中的主要組分，其所含的血竭素具有活血化瘀、祛腐生肌、消炎鎮(zhèn)痛、止血斂瘡、軟堅(jiān)散結(jié)的作用，為處方中的重要活性成分，我們通過(guò)查閱有關(guān)文獻(xiàn)[1-3]，采用流動(dòng)相的優(yōu)化法，進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，建立了高效液相色譜法測(cè)定本品中血竭素含量的方法，并對(duì)色譜條件進(jìn)行方法學(xué)研究，可以達(dá)到基本分離，靈敏度好，且具準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

儀器：島津高效液相色譜儀。試劑：乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、磷酸二氫鈉、磷酸等，其他試劑均為分析純。對(duì)照品：血竭素高氯酸鹽為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（供含量測(cè)定用），使用前置干燥器中干燥至恒重。樣品：跳骨片（批號(hào)060801、060802、060803）均為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Chromasil C18250×4.6mm 5u）流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉（35:45），用磷酸調(diào)PH值為 3.14為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：440nm，流速：1.0ml/min，柱溫：40℃。

2.2陰性干擾試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品20mg置10ml棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液超聲2min溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取該液1ml置25ml棕色量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取本品20片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取1.5g，精密稱(chēng)定，置25ml棕色量瓶中加 3%磷酸甲醇溶液振搖 3min溶解并定容，用微孔濾膜（0.45um）濾過(guò)，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

陰性溶液的制備：按處方量稱(chēng)取不含血竭的各味藥材，照跳骨片制備方法制得陰性樣品，稱(chēng)取適量，同供試品方法制備，即得。

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果，在選定的色譜條件下，血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(含血竭素72.62%)主峰保留時(shí)間為18.296，樣品溶液主峰保留時(shí)間為18.286，而陰性溶液色譜圖中，與對(duì)照品峰保留時(shí)間相同的位置，無(wú)任何峰出現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明陰性不干擾本品中血竭素的含量測(cè)定。

2.3線(xiàn)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（含血竭素 72.62%）適量，加甲醇制成每 1ml含27.89μg的溶液。在選定的色譜條件下，精密吸取上述對(duì)照品溶液 5μl、8μl、10μl、12μl、15μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1及附圖。

表1 血竭素線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

以血竭素的進(jìn)樣量為自變量，以對(duì)應(yīng)的峰面積（A）為因變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，線(xiàn)性關(guān)系如圖1所示，線(xiàn)性方程為：y=6E+06X+7718.8，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果表明：血竭素進(jìn)樣量在0.13945g～0.41835g范圍內(nèi)，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 血竭素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取本品20片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取 1.5g，精密稱(chēng)定，置 25ml棕色量瓶中加3%磷酸甲醇溶液振搖3min溶解并定容，用微孔濾膜（0.45um）濾過(guò)，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。分別于0h、2h、4h、8h、12h精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。血竭素峰面積值的RSD為1.72%，說(shuō)明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)取本品50片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取 1.5g，精密稱(chēng)定，置 25ml棕色量瓶中加3%磷酸甲醇溶液振搖3min溶解并定容，用微孔濾膜（0.45um）濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品17.87mg置10ml棕色量瓶中加3%磷酸甲醇溶液超聲 2min溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取該液1ml置25ml棕色量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

分別吸取對(duì)照品溶液和各供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，測(cè)得峰面積值并計(jì)算含量，RSD為1.06%，重現(xiàn)性好。

2.6回收率試驗(yàn)采用加樣回收法測(cè)定。精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（含血竭素72.62%）16.26mg置10ml棕色量瓶中加3%磷酸甲醇溶液超聲2min溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取該液1ml置25ml棕色量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

另精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（含血竭素72.62%)13.69mg置100ml棕色量瓶中，加適量3%磷酸甲醇溶液超聲 2min溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)加樣儲(chǔ)備液。

取本品50片，除去包衣，研細(xì)（由重復(fù)性試驗(yàn)可知每克藥粉含血竭素的量為 0.5158mg），稱(chēng)取量分別為 1#0.52521g、2#0.52158g、3#0.52062g、4#0.80199g、5#0.71078g、6#0.75803g、7#1.03302g、8#1.12115g、9#1.09013g，分置25ml棕色量瓶中依次對(duì)應(yīng)加入對(duì)照儲(chǔ)備液4ml（1#-3#）、5ml（4#-6#）、6ml（7#-9#）后，加3%磷酸甲醇溶液振搖3min溶解并定容，用微孔濾膜（0.45um）濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。在選定的色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。平均回收率為99.69%，RSD為1.06%，本品具有較好的回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血竭素回收率測(cè)定結(jié)果

2.7樣品測(cè)定根據(jù)以上的測(cè)定方法測(cè)定了3批樣品，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

血竭素的HPLC測(cè)定法的色譜條件為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉（35:45），用磷酸調(diào)PH值為3.14為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為 440nm；柱溫：40℃，理論板數(shù)按血竭素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。用此色譜條件采用HPLC法測(cè)定跳骨片中的血竭素的含量靈敏度好，準(zhǔn)確性高。

[1]郭素華,潘馨.跳骨片質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2001,1(36).

[2]尤獻(xiàn)民,鄒桂欣,王樹(shù)實(shí),等.HPLC法測(cè)定胃潰瘍膠囊中血竭素的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2003,4(10).

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南長(zhǎng)沙 410007

2 成都百事達(dá)醫(yī)藥科技有限公司，四川成都 610000