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    低營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)絮菌Rheinheimera aquimaris P6的分離篩選及其絮凝特性研究

    2012-05-07 01:47:32劉春爽趙東風(fēng)國(guó)亞?wèn)|張?jiān)撇?/span>
    化學(xué)與生物工程 2012年2期
    關(guān)鍵詞:絮凝劑氮源碳源

    劉春爽,趙東風(fēng),國(guó)亞?wèn)|,蔡 蕓,張?jiān)撇?/p>

    (中國(guó)石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266555)

    生物絮凝劑作為一種安全、高效、無(wú)二次污染、易生物降解的新型藥劑,在水處理領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[1],但存在生產(chǎn)成本高、用量大的缺點(diǎn),難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?;瘧?yīng)用[2]。因此,分離篩選高效的產(chǎn)絮菌種成為降低生物絮凝劑生產(chǎn)成本的重要途徑。

    目前,人們已分離篩選出多種產(chǎn)絮菌,如Bacillussp. F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]等均具有較高的產(chǎn)絮能力,所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率在90%以上。然而,這些產(chǎn)絮菌的產(chǎn)絮條件大都為富營(yíng)養(yǎng)條件,如Bacillussp.F19所需底物為20 g·L-1蔗糖、2.5 g·L-1酵母膏;ProteusmirabilisTJ-1所需底物為10 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1蛋白胨;Bacillusfirmus所需底物為20 g·L-1葡萄糖、5.0 g·L-1蛋白胨,這無(wú)形中增加了生物絮凝劑的生產(chǎn)成本。若能分離篩選低營(yíng)養(yǎng)條件下的高效產(chǎn)絮菌,優(yōu)化其產(chǎn)絮條件,從源頭降低絮凝劑生產(chǎn)成本,對(duì)于推動(dòng)我國(guó)生物絮凝劑的工業(yè)化應(yīng)用具有非常重大的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

    基于此,作用采用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從海洋底泥中分離篩選高效產(chǎn)絮菌株,優(yōu)化產(chǎn)絮條件,并通過(guò)紫外光譜、蛋白和糖顯色反應(yīng)、紅外光譜等手段分析低營(yíng)養(yǎng)條件下所得絮凝劑的組成及結(jié)構(gòu)特征,擬為降低生物絮凝劑的生產(chǎn)成本提供參考。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 產(chǎn)絮菌的分離篩選

    采用平板劃線分離法,以海洋底泥為接種物、以低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基,經(jīng)多次純化后得到高效產(chǎn)絮菌。

    低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:葡萄糖0.5 g·L-1,淀粉0.5 g·L-1,酵母膏0.5 g·L-1,蛋白胨0.5 g·L-1,酪蛋白0.5 g·L-1,K2HPO40.3 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,pH值7.6。

    1.2 生物絮凝劑樣品的制備

    將制取的生物絮凝劑發(fā)酵液在12 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min。取上清液濃縮至體積減半,加入3 BV 4 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇,振蕩至出現(xiàn)白色絮體。常溫、5000 r·min-1離心15 min,用無(wú)水乙醇洗滌沉淀,溶于少量蒸餾水中,加入3 BV 4 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇,振蕩后于5000 r·min-1、常溫離心15 min,反復(fù)2次,將沉淀于40 ℃真空干燥得生物絮凝劑樣品。

    1.3 絮凝效果的測(cè)定

    絮凝效果采用高嶺土評(píng)價(jià)方法[6]測(cè)定,用絮凝率(μ)表征:

    式中:A為空白水樣上清液的濁度;B為待測(cè)水樣上清液的濁度。

    1.4 分析檢測(cè)

    生物絮凝劑的紫外光譜分析、蛋白和糖顯色反應(yīng)分析參照文獻(xiàn)[7,8]。

    生物絮凝劑的紅外光譜分析:取1 mg生物絮凝劑樣品與150 mg KBr粉末放入瑪瑙研缽中在紅外燈下輕輕研磨,經(jīng)壓片機(jī)壓成薄片,上機(jī)測(cè)定,在500~4000 cm-1掃描。

    水中油含量:采用萃取-紅外分光光度法(GB/T 16488-1996)[9]測(cè)定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 產(chǎn)絮菌的分離篩選

    采用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)多次稀釋平板分離和平板劃線純化,從海洋底泥中篩選出絮凝率在80%以上的菌株7株,其中一株命名為P6的菌株菌落特征為橙黃色、圓形、光滑,發(fā)酵液特別粘稠,絮凝效果較好,絮凝率在85%左右。因此,選擇此菌株進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),研究其發(fā)酵產(chǎn)絮特性。該菌為球狀,革蘭氏陰性,屬好氧細(xì)菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將16S rDNA測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)與Rheinheimeraaquimaris相似度最高,達(dá)99%。因此,P6菌株和其所產(chǎn)絮凝劑被分別命名為RheinheimeraaquimarisP6和 MBF-P6。

    2.2 影響Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮的關(guān)鍵因素

    2.2.1 培養(yǎng)基組成

    不同的碳源和氮源對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮能力有不同的影響。分別以葡萄糖、淀粉、蔗糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、果糖、乳糖、木糖、乙醇作為碳源,以尿素、NH4Cl、NaNO3、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白作為氮源,經(jīng)相同條件發(fā)酵后,測(cè)定絮凝率,結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 不同碳源(a)和氮源(b)對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

    由圖1可看出,價(jià)格低廉的葡萄糖作為碳源、尿素作為氮源時(shí)所產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果最好。

    碳氮比對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響見(jiàn)圖2。

    圖2 碳氮比對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

    由圖2可看出,碳氮比為1∶1時(shí),RheinheimeraaquimarisP6的絮凝率最高,產(chǎn)絮效果最好;碳氮比高于或低于1∶1都會(huì)導(dǎo)致絮凝效果變差。由圖2還可看出,當(dāng)碳氮比為5∶1(葡萄糖10 g·L-1,尿素2 g·L-1)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最好,但絮凝效果較差。

    RheinheimeraaquimarisP6在含有1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后絮凝率達(dá)到最高,為87.32%。與現(xiàn)有產(chǎn)絮菌Bacillussp.F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]相比,RheinheimeraaquimarisP6的產(chǎn)絮成本(培養(yǎng)基費(fèi)用)降低50%~80%。

    2.2.2 初始pH值

    以1.5 g·L-1葡萄糖作為碳源、1.5 g·L-1尿素作為氮源,調(diào)整初始pH值為3~10,考察其對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 初始pH值對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

    由圖3可看出,培養(yǎng)基初始pH值為4~9時(shí),發(fā)酵液的絮凝率均在85%以上;當(dāng)pH值為7時(shí),絮凝率達(dá)到最高,為89.39%;過(guò)低或過(guò)高的pH值均對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮有抑制作用。表明RheinheimeraaquimarisP6對(duì)環(huán)境中pH值要求不嚴(yán)格,易于培養(yǎng)。

    2.2.3 金屬離子

    0.2 g·L-1的Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Zn2+、Cu2+對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響見(jiàn)圖4。

    圖4 金屬離子對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

    由圖4可看出,不同的金屬離子對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響不同。Mg2+、Fe2+對(duì)菌株RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮能力有促進(jìn)作用,而Mn2+、Zn2+、Cu2+則有明顯的抑制作用。這可能是由于,Mg2+是構(gòu)成細(xì)菌體內(nèi)某些酶的活性成分,并對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)如核糖體、細(xì)胞膜等的穩(wěn)定性起著重要作用,Mg2+的加入有助于促進(jìn)胞外聚合物中多糖的生成,從而增加絮凝劑產(chǎn)量[10];Fe2+是微生物生長(zhǎng)所必需的元素,是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性基及鐵卟啉的組成部分,F(xiàn)e2+濃度適宜時(shí),酶合成效果較好,從而使得絮凝劑產(chǎn)量明顯增加;而Mn2+、Zn2+、Cu2+是重金屬,對(duì)微生物具有毒害作用,抑制絮凝劑的產(chǎn)生。

    2.2.4 最佳產(chǎn)絮效果

    在1.5 g·L-1葡萄糖為碳源、1.5 g·L-1尿素為氮源、培養(yǎng)基初始pH值為7、投加0.2 g·L-1Fe2+的最佳培養(yǎng)條件下,RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率達(dá)到90.2%。可見(jiàn)RheinheimeraaquimarisP6是一株產(chǎn)絮性能穩(wěn)定的高效產(chǎn)絮菌株。

    2.3 生物絮凝劑的組成及結(jié)構(gòu)特征

    提取RheinheimeraaquimarisP6發(fā)酵液粗產(chǎn)品,在200~600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明,紫外掃描曲線在260 nm處無(wú)吸收峰,但在280 nm和200 nm處有吸收峰,這說(shuō)明絮凝劑中幾乎不含核酸,但含有蛋白質(zhì)和糖類。因此可以定性判斷該絮凝劑的有效成分是蛋白質(zhì)和糖類。

    經(jīng)茚三酮、蒽酮等顯色劑進(jìn)行生化反應(yīng)分析,進(jìn)一步確定RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑中含有蛋白質(zhì)和多糖。

    生物絮凝劑樣品的紅外光譜見(jiàn)圖5。

    圖5 Rheinheimera aquimaris P6所產(chǎn)生物絮凝劑的紅外光譜

    由圖5可看出,3414.46 cm-1處寬而強(qiáng)的特征吸收峰是由O-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的,可知該絮凝劑結(jié)構(gòu)中必然含有大量的-OH;2960.87 cm-1和2930.73 cm-1處的2個(gè)吸收峰是由飽和C-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的,并且同時(shí)存在-CH3和-CH2-;1700~1600 cm-1間的強(qiáng)吸收峰是由C=O鍵伸縮振動(dòng)引起的;1000 cm-1附近出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由C-O鍵伸縮振動(dòng)引起的,由此可判定該絮凝劑結(jié)構(gòu)中存在-COOH;1026.09 cm-1和1069.82 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)吸收峰,判斷還存在另外一種C-O鍵,應(yīng)為C-O-C中的C-O鍵伸縮振動(dòng)引起的。因此,可以確定RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑的活性成分中含有多糖物質(zhì)。

    用考馬斯亮蘭、蒽酮法測(cè)定發(fā)酵液粗產(chǎn)品中多糖和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明,RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑含47.9%蛋白質(zhì)、47.3%糖,約為1∶1。

    3 結(jié)論

    (1)利用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從海洋底泥中篩選到一株高效產(chǎn)絮菌株P(guān)6,經(jīng)16S rDNA鑒定其為Rheinheimeraaquimaris菌屬。

    (2)RheinheimeraaquimarisP6 產(chǎn)絮最適碳氮源為1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素,最佳初始發(fā)酵pH值為7,在添加0.2 g·L-1Fe2+的條件下,所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率達(dá)90.2%,與現(xiàn)有產(chǎn)絮菌株相比,絮凝劑生產(chǎn)成本降低50%~80%。

    (3)菌株RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑含有-OH、C-H、C-O和C=O鍵,由蛋白質(zhì)和多糖組成,含量分別為47.9%、47.3%,蛋白質(zhì)和多糖比例約為1∶1。

    (4)本研究為從源頭降低絮凝劑生產(chǎn)成本、推動(dòng)我國(guó)生物絮凝劑的工業(yè)化應(yīng)用提供了重要的信息。

    參考文獻(xiàn):

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