標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)流程

曹龍凱，郭春華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與與技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，成都 610041）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)已經(jīng)成為檢測(cè)不同樣品間基因表達(dá)水平定量差異的權(quán)威性方法，但是也出現(xiàn)了許多缺陷，包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理、對(duì)照和重復(fù)缺乏、分析方法和報(bào)告形式多樣、RNA樣品質(zhì)量、引物和探針低劣選擇等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)出版物所需最小信息量（MIQE）是一套國(guó)際新推出的指導(dǎo)方針，對(duì)RT-qPCR的試驗(yàn)和發(fā)表文章所必需的信息提出了最低限度的標(biāo)準(zhǔn)[1]。MIQE與蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)、基因組序列、RNA干擾、代謝研究和NDA微陣列分析的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一樣，作為RT-qPCR的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)——MIEQ也被收入MIBBI[2-8]。MIQE對(duì)RT-qPCR的過(guò)程做了詳盡的闡述，從而使科學(xué)工作者能獲得一致的、高質(zhì)量的RT-qPCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，可以規(guī)范試驗(yàn)操作，提高研究者對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可信度，增強(qiáng)試驗(yàn)的透明度，促進(jìn)試驗(yàn)室之間的一致性，進(jìn)一步規(guī)范qPCR的儀器和試劑的研發(fā)生產(chǎn)[9-12]。

MIQE所提供的檢測(cè)列表包含85個(gè)參數(shù)，滿(mǎn)足了所有雜志的評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)，確保了試驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，應(yīng)對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄的高動(dòng)態(tài)性和樣品操作及下游處理步驟的多變性，使通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估的試驗(yàn)結(jié)果具有一致性、可靠性和可比性[1]。另外，還規(guī)范了RT-qPCR的專(zhuān)用術(shù)語(yǔ)，以統(tǒng)一實(shí)時(shí)定量PCR的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]。

根據(jù)MIQE指南，一個(gè)典型的RT-qPCR試驗(yàn)流程包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、RNA提取、引物和探針設(shè)計(jì)、RT-PCR、數(shù)據(jù)分析、對(duì)照組、重復(fù)數(shù)。從試驗(yàn)條件到樣品操作，都要進(jìn)行精心的安排。本文介紹了一套標(biāo)準(zhǔn)化的RT-qPCR的試驗(yàn)方法，為RT-qPCR試驗(yàn)提供參考。

1 RT-qPCR試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于mRNA的超敏感，反應(yīng)需要在嚴(yán)格的調(diào)控下進(jìn)行，適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)設(shè)計(jì)是研究基因表達(dá)成功的關(guān)鍵，花一定的時(shí)間在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上是很必要的。試驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容包括樣品抽提方法、保存方法、解凍和均質(zhì)化過(guò)程、對(duì)照組設(shè)置、靶基因和內(nèi)參基因選擇，生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)次數(shù)等都要進(jìn)行嚴(yán)格的考慮，從而可以減少試驗(yàn)結(jié)果的可變性，保證其順利進(jìn)行。

2 RNA提取

2.1 RNA提取的原理和方法

組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)RNA的純化去除蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA的過(guò)程。

細(xì)胞裂解法有苯酚法和β-巰基乙醇法。苯酚法是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大多數(shù)動(dòng)植物材料，但對(duì)次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差；β-巰基乙醇法適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料；對(duì)于次生代謝物多的材料，一些生物公司亦推出了RNA提取試劑，不同的提取方法適用于不同的樣本材料，試驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

RNA的純化及沉淀方法包括有機(jī)溶劑抽提法和硅基質(zhì)吸附法。有機(jī)溶劑抽提法通常用氯仿抽提RNA，去除蔗糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；硅基質(zhì)吸附法是利用硅基質(zhì)對(duì)核酸特異的吸附能力，該法因操作方便、快捷、不使用有毒的溶劑（苯酚、氯仿）等優(yōu)點(diǎn)，成為了核酸純化的首選。

現(xiàn)在的RNA提取試劑盒綜合了上述細(xì)胞裂解和RNA純化的一系列步驟，提取方便，易于操作，是一種理想的試劑盒。但若要提取一些特殊的樣品，可選用專(zhuān)用的試劑盒，例如動(dòng)物組織提取試劑盒，該類(lèi)試劑盒比綜合提取試劑盒效果更好。另外，在使用前應(yīng)對(duì)試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到預(yù)期的效果。

2.2 樣品的預(yù)處理

樣品的預(yù)處理方法要根據(jù)樣品的不同來(lái)選擇不同的方法，植物材料需要液氮研磨，動(dòng)物材料需要?jiǎng)驖{、液氮研磨，細(xì)菌需要用溶酶菌破壁，酵母需要液氮研磨、玻璃珠處理或lyticase酶法破壁。如果樣品在采集后無(wú)法立即處理，需要放置一段時(shí)間，應(yīng)先將材料在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱或直接保存在液氮中。

3 RNA質(zhì)量的控制

RT-qPCR試驗(yàn)流程中，高純度和高完整性的RNA是試驗(yàn)的關(guān)鍵。不純的RNA樣品會(huì)抑制PCR反應(yīng)，產(chǎn)生偏離的數(shù)據(jù)；不完整的RNA會(huì)產(chǎn)生不正確和可變的定量結(jié)果[14]。RNA用于不同的后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同，cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整且無(wú)酶等抑制物殘留；Northern blot試驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物要求較低；RT-PCR試驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。

3.1 RNA純度的檢測(cè)

采用分光光度法檢測(cè)RNA的純度，以O(shè)D260/230值作為參考值。OD260/280值為1.9～2.1，可以認(rèn)為RNA純度較好；OD260/280值＜1.8，則表明有蛋白質(zhì)雜質(zhì)；OD260/280值＞2.1，說(shuō)明RNA已經(jīng)降解；OD260/230值＞2.0，則表明裂解液中有β-巰基乙醇和異硫氰酸胍殘余。另外，采用TE溶解或洗脫RNA會(huì)使OD260/280值增加。總RNA濃度的計(jì)算公式見(jiàn)式（1）：

3.2 RNA完整性鑒定

根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)的不同，對(duì)鑒定的要求也有所差異。一般可分為變性電泳和常規(guī)電泳，由于變性電泳操作步驟比較復(fù)雜，所以在不太嚴(yán)格的試驗(yàn)中，RNA的電泳可以用常規(guī)的1%瓊脂糖凝膠電泳?？俁NA在普通瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)的條帶與變性凝膠上的一致，可以觀察到一大一?。?8S和18S）兩條帶，其大條帶的亮度是小條帶亮度的200%，則提示RNA完整，這種方法成本低，但判斷上具有一定主觀性，并且需要總RNA 200 ng，如果樣品稀少，則相對(duì)浪費(fèi)。使用光密度掃描儀對(duì)rRNA條帶的亮度進(jìn)行掃描可以改善上述方法，雖然28S/18S的值在不同組織中有所變動(dòng)，不過(guò)比值為1～2，則說(shuō)明RNA樣品的完整性好。

然而對(duì)RNA完整性要求較高的后續(xù)試驗(yàn)，如Northern blot和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，則需要通過(guò)微流體電泳系統(tǒng)，對(duì)RNA的完整性做出客觀的、準(zhǔn)確的評(píng)判[15]。該系統(tǒng)是目前對(duì)RNA的濃度質(zhì)量（從pg到ng級(jí)）和完整性的檢測(cè)最完善的系統(tǒng)，可以生成一塊虛擬膠，基于電泳圖的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，也可以提供RNA樣品的客觀判斷以及降解樣品的篩選[16]。

綜上所述，通過(guò)確保RNA的純度和質(zhì)量的一致性可以降低生物學(xué)重復(fù)的差異[15]。建議在RNA樣品符合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)立即進(jìn)行RT-PCR，以便在檢測(cè)后保持其完整性。

4 引物和探針設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)是PCR步驟中十分關(guān)鍵的一步，引物的好壞決定著試驗(yàn)的成功與否。對(duì)于RT-qPCR，引物設(shè)計(jì)和目標(biāo)序列選擇的要求就更嚴(yán)格了。依照MIQE指南，熒光定量PCR的引物必須是以?xún)蓚€(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物，避免基因組DNA的擴(kuò)增，且在發(fā)表文章中必須提供每個(gè)目的基因和對(duì)照基因的da?tabase檢索編號(hào)，引物和探針的外顯子位置。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)注意先選擇好探針，然后再設(shè)計(jì)引物，使之盡可能的靠近探針；所選序列應(yīng)是高特異的，盡量選擇最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)先檢驗(yàn)，若無(wú)法避免就要相應(yīng)提高退火溫度；擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度應(yīng)＜400 bp，理想的是100～150 bp，太短也有其弊端，如影響片段回收；GC含量應(yīng)在50%～65%，GC含量太高，影響引物的退火溫度，其容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，從而影響擴(kuò)展增效率及產(chǎn)生非特異信號(hào)；盡量避免連續(xù)的G或C出現(xiàn)；引物和探針配檢，以避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；合成好的探針，在用之前要先離心，用雙蒸水（滅菌）稀釋成25 pmol·μL-1的濃度，然后于-20℃避光保存。

設(shè)計(jì)引物需要的軟件有Primer 6.0（設(shè)計(jì)夸外顯子引物）、Primer 5.0（檢測(cè)上下游引物的錯(cuò)配）、Ol?ige 6.0（檢測(cè)上、下引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)出現(xiàn)能值的高低）。另外，設(shè)計(jì)好的引物還要通過(guò)NCBI中的Primer-Blast來(lái)進(jìn)行比對(duì)，以確保目的基因的特異性。MFOLD程序可用來(lái)分析擴(kuò)增子是否存在阻礙有效擴(kuò)增的二級(jí)機(jī)構(gòu)[17]。

5 反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證和RT-qPCR擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR擴(kuò)增中，MIEQ規(guī)定聚合酶的濃度和性質(zhì)、cDNA的量、鎂離子濃度、buffer的化學(xué)成分、反應(yīng)體積以及RT-qPCR儀的循環(huán)條件都必須注明。

5.1 反轉(zhuǎn)錄

由于RNA酶在環(huán)境中廣泛存在，RNA提取完成后，應(yīng)盡快進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以避免RNA樣品在反轉(zhuǎn)錄之前反復(fù)凍融而導(dǎo)致RNA樣品的降解。在確保RNA質(zhì)量后，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在引物的選擇方面，根據(jù)RT引物數(shù)據(jù)庫(kù)且視試驗(yàn)的具體情況而定，選擇隨機(jī)引物、Oligo dT及基因特異性引物，對(duì)于短的不具有發(fā)夾機(jī)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，3種引物都可以[18-19]。

RT-PCR分為一步法和兩步法，可以根據(jù)不同目的選用不同的方法。若要達(dá)到高靈敏度的效果，建議用一步法；如果RT-PCR使用不同的引物，同時(shí)要得到高特異、高保真、長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果，就采用兩步法。此外，MIQE中對(duì)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程要求設(shè)置無(wú)轉(zhuǎn)錄（NRT）對(duì)照。

5.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證

RT-qPCR之前，要對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物是否是目的片段。具體做法是：做普通PCR，然后膠回收產(chǎn)物，連接到質(zhì)粒上；對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確定是目的片段。

5.3 RT-qPCR擴(kuò)增與驗(yàn)證

RT-qPCR擴(kuò)增流程中，PCR的效率、線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍、退火溫度、融解曲線(xiàn)、擴(kuò)增子的凝膠電泳分析以及染料法所需要的試劑等，都要經(jīng)過(guò)測(cè)定和校準(zhǔn)[20-21]。引物的優(yōu)化、引物濃度、退火溫度都會(huì)影響到PCR的效率，進(jìn)而影響試驗(yàn)的質(zhì)量。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立，來(lái)評(píng)價(jià)PCR的擴(kuò)增效率。定量標(biāo)準(zhǔn)物可以是cDNA、質(zhì)粒DNA、特定生物體樣本的RNA或DNA以及是世界上公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。對(duì)于定量標(biāo)準(zhǔn)的稀釋MIQE也做了詳細(xì)的闡述，另外歸一化是可信賴(lài)的RT-qPCR的重要組成部分[22-23]。目前，常用△△Cq法對(duì)樣品和Ref?erence RNA基因不同濃度進(jìn)行歸一化，從而可以控制由抽提率、反轉(zhuǎn)率和擴(kuò)增效率產(chǎn)生的差異[24]。但是目的基因和對(duì)照基因必須在相似的擴(kuò)增效率下。MIQE規(guī)定，在所提交的文章中，不僅要有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，還要有注明斜率值，擴(kuò)增效率=10-1/slope-1。

擴(kuò)增效率的高低可以直接出PCR問(wèn)題，低的擴(kuò)增效率（＜90%）可能是由于Tag酶的活性低，抑制劑的污染，退火溫度未優(yōu)化，引物設(shè)計(jì)不合理或擴(kuò)增子含二級(jí)結(jié)構(gòu)；過(guò)高擴(kuò)增效率（＞105%）的原因一般是由于引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，不過(guò)人為的操作不當(dāng)移液器的不準(zhǔn)或不當(dāng)操作、離心不當(dāng)?shù)榷绊憯U(kuò)增效率的高低是經(jīng)常發(fā)生的。

在繪制標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，樣品稀釋倍數(shù)應(yīng)確保覆蓋試驗(yàn)中可能用到的模板濃度，寬的動(dòng)態(tài)范圍是必須的。理想狀態(tài)下，擴(kuò)增曲線(xiàn)的分布是均一的，間隔也代表著每次擴(kuò)增的倍數(shù)，擴(kuò)增效率應(yīng)保持在90%～105%。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的r或R2可代表符合回歸曲線(xiàn)的程度，RT-qPCR理想的r絕對(duì)值應(yīng)＞0.990或R2＞0.998。使用Excel電子表格添加趨勢(shì)線(xiàn)功能，以確定每對(duì)引物的使用cDNA動(dòng)態(tài)濃度。

6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析方法因所選定量方法的差異而有所差異。絕對(duì)定量是通過(guò)樣品的Cq值與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較得到的；相對(duì)定量是一定量的試驗(yàn)組和對(duì)照組中目的基因的相對(duì)比率。無(wú)論是絕對(duì)定量還是相對(duì)定量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)是必不可少的；絕對(duì)定量中每次的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品必須與待測(cè)樣品同時(shí)平行擴(kuò)增；而相對(duì)定量在比較多個(gè)樣本時(shí)，選擇一個(gè)樣品作為對(duì)照樣本，其他所有樣本目標(biāo)基因的表達(dá)都以對(duì)照樣本上調(diào)或下調(diào)，一般以基準(zhǔn)或未處理樣本作為對(duì)照。

6.1 內(nèi)參基因

在RT-qPCR試驗(yàn)中，內(nèi)參基因被用來(lái)作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照，以校正作為模板得cDNA所存在得數(shù)量差異[25]。一個(gè)好的內(nèi)參基因應(yīng)確保在不同的組織、不同的處理?xiàng)l件下表達(dá)都無(wú)變化。往往在試驗(yàn)中，要選用多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行比較，而選擇好的內(nèi)參基因，才能使試驗(yàn)數(shù)據(jù)被信服。不同的條件或時(shí)間點(diǎn)下△Cq≤0.5。建議在試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)至少3個(gè)或3個(gè)以上位于不同代謝途徑中的特定內(nèi)參基因，并對(duì)表達(dá)差異最小的幾個(gè)基因進(jìn)行幾何平均以準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)[26-29]。

內(nèi)參基因確定以后，可以采用Livak法，也就是2-△△Ct法、參照基因的△Ct法或Pfaffl法進(jìn)行分析，每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。

6.2 試驗(yàn)重復(fù)性與重現(xiàn)性

試驗(yàn)的重復(fù)性與重現(xiàn)性是必須考慮的因素，因?yàn)樵谠囼?yàn)中有兩種可變因素可能會(huì)影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。分別是生物學(xué)差異和技術(shù)差異。生物學(xué)差異是不同個(gè)體或組織樣品間基因表達(dá)的差異所致；技術(shù)差異是試驗(yàn)藥品、器材不同和操作不當(dāng)?shù)热藶橐蛩貙?dǎo)致。為了減少生物學(xué)和技術(shù)差異對(duì)試驗(yàn)帶來(lái)的影響，可以通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)加以避免。一般除了設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)樣本還要設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并且每個(gè)重復(fù)要設(shè)置至少兩個(gè)技術(shù)重復(fù)，另外，再加上兩個(gè)無(wú)模板（NTC）對(duì)照。如果試驗(yàn)是在對(duì)照組和處理組之間進(jìn)行的比較，設(shè)置的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品應(yīng)該來(lái)源于獨(dú)立試驗(yàn)中分別進(jìn)行處理的樣品[30-31]。

7 展 望

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)自建立以來(lái)，發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，表現(xiàn)出許多優(yōu)勢(shì)。近些年來(lái)，許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對(duì)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行不斷深入的研究和改進(jìn)，使熒光PCR技術(shù)得到了進(jìn)一步的完善，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出了許多新的熒光PCR技術(shù)。隨著標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的不斷發(fā)展該技術(shù)將在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等廣泛的領(lǐng)域中得到更加廣泛的推廣應(yīng)用。

[1] Bustin S A,Benes V,Garson J A,et al.The MIQE guidelines:min?imum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J].Clin Chem,2009,55（4）:611-622.

[2] Taylor C F,Paton N W,Lilley K S,et al.The minimum informa?tion about a proteomics experiment（MIAPE）[J].Nat Biotechnol,2008,25（8）:887-893.

[3] Field D,Garrity G,Gray T,et al.The minimum information about a genome sequence（MIGS）specification[J].Nat Biotechnol,2007,26（5）:541-547.

[4] Echeverri C J,Beachy P A,Baum B,et al.Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAiscreens[J].Nat Meth?ods,2006,3（10）:777-779.

[5] Haney S A.Increasing the robustness and validity of RNAiscreens[J].Pharmacogenomic,2007,8（8）:1 037-1 049.

[6] Sansone S A,Fan T,Goodacre R,et al.The metabolomics stan?dards initiative[J].Nat Biotechnol,2007,25（8）:846-848.

[7]Brazma A,Hingamp P,Quackenbush J,et al.Minimum informa?tion about a microarray experiment（MIAME）-toward standards for microarray data[J].Nat Genet,2001,29（4）:365-371.

[8] Taylor C F,Field D,Sansone S A,et al.Promoting coherent mini?mum reporting guidelines for biological and biomedical investiga?tions:the MIBBI project[J].Nat Biotechnol,2008,26（8）:808-889.

[9] Burns MJ,Valdivia H,Harris N.Analysis and interpretation of da?ta from real-time PCR trace detection methods using quantitation of GM soya as a model system[J].Analytical and Bioanalytial Chemistry,2004,378（6）:1 616-1 623.

[10]Burns M J,Nixon G J,Foy C A,et al.Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods-evaluation of outliers and comparisonof calibration curves[J].BMC Biotechnol,2005（5）:31.

[11] Ellison S L,English C A,Burns M J,et al.Routes to improving the reliability of low level DNA analysis using real-time PCR[J].BMC Biotechnol,2006（6）:33.

[12] Burns M J,Valdivia H.Modelling the limit of detection in re?al-time quantitative PCR[J].Eur Food Res Technol,2007,226（6）:1 513-1 524.

[13] Lefever S,Hellemans J,Pattyn F,et al.RDML:Structured lan?guage and reporting guidelines for real-time quantitative PCR da?ta[J].Nucleic Acid Res,2009,37（7）:2 065-2 069.

[14] Fleige S,Pfaffl M W.RNA integrity and the effect on the realtime qRT-PCR performance[J].Mol Aspects Med,2006,27:126-139.

[15] Imbeaud S,Grandens E,Bonlaneper V,et al.Towards standardiza?tion of RNA quality assessment using userindependent classifiers of microcapillary electrophoresis traces[J].Nucleic Acid Res,2005,33-56.

[16] Denisov V,Strong W,Walder M,et al.Development and valida?tion of RQI:An RNA puality indicator for the Experion automated electrophoresis system[J].Bio-Rad Bulletin,2008,1 108:1 103-1 108.

[17]Zuker M.MFOLD web server for nucleic acid folding and hybridiza?tion prediction[J].Nucleic Acid Res;2003,31（13）:3 406-3 415.

[18] Pattyn F,Robbrecht P,De Paepe A,et al.RTPrimerDB:the re?al-time PCRprimer and probe database,major update[J].Nucleic Acids Res,2006,34（1）:684-688.

[19] Pattyn F,Speleman F,De Paepe A,et al.RTPrimerDB:the re?al-time PCR primer andprobe database[J].Nucleic Acids Res,2003,31（1）:122-123.

[20] Nolan T,Hands R E,Bustin S A.Quantification of mRNA using real-time RT-PCR[J].Nat Protoc,2006（1）:1 559-1 582.

[21] Ririe K M,Rasmussen R P,Wittwer C T.Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction[J].Anal Biochem,1997,245（2）:154-160.

[22]Cronin M,Ghosh K,Sistare F,et al.Universal RNA reference ma?terials for gene expression[J].Clin Chem,2004,50（8）:1 464-1 471.

[23] Novoradovskaya N,Whitfield M L,Basehore L S,et al.Universal Reference RNA as a standard for microarray experiments[J].BMC Genomics,2004（5）:20.

[24] Hellemans J,Mortier G,De Paepe A,et al.qBase relative quantifi?cation framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data[J].Genome Biol,2007（8）:19.

[25] Gutierrez L,manriat M,Guemin S,et al.The lack of a systematic validation of reference genes:a serious pitfall undervalued in re?verse transcription-ploymerase chain reaction（RT-PCR）analy?sis in plants[J].Plant Biotechnol,2008,6（6）:609-618.

[26] Vandesompele J,et al.Accurate normalization of real-time quan?titative RT-PCR data by geometric averaging of multiple inter?nal control genes[J].Genome Biol,2002,34:1-11.

[27] Expósito-Rodríguez M,Borges A A,Borges-Pérez A,et al.Selec?tion of internal control genes for quantitative real-time RT-PCR studies during tomato development process[J].BMC Plant Biol,2008,22（8）:131.

[28] Artico S,Nardeli S M,Brilhante O,et al.Identification and evalua?tion of new reference genes in Gossypium hirsutum for accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data[J].BMC Plant Biol,2010,21（10）:49.

[29] Barsalobres-Cavallari C F,Severino F E,Maluf M P,et al.Identi?fication of suitable internal control genes for expression studies in Coffea arabica under different experimental conditions[J].BMC Mol Biol,2009,6（10）:1.

[30] Willems E,Leyns L,Vandesompele J.Standardization of realtime PCR gene expression data from independent biological repli?cates[J].Anal Biochem,2008,379:127-129.

[31] Vandesompele J D P K,Pattyn F,Poppe B,et al.Accurate nor?malization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol,2002（3）:7.