耕作深度與翻壓綠肥對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

祖韋軍，潘文杰，薛亞軍，楊 磊，林葉春

（1畢節(jié)市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境與資源保護(hù)站，貴州畢節(jié) 551700；2貴州省煙草專賣局，貴州貴陽 550004；3畢節(jié)市農(nóng)業(yè)機(jī)械研究所，貴州畢節(jié) 551700；4湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖南長沙 410007；5貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽 550081）

0 引言

【研究意義】煙草是煙區(qū)農(nóng)民收入和國家稅收的重要來源。貴州黃壤煙區(qū)存在長期連作、輪作不足及深耕不足等問題，導(dǎo)致煙區(qū)土壤出現(xiàn)土層淺薄、土壤環(huán)境質(zhì)量下降、微生物多樣性降低等問題，從而影響烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量（賈志紅等，2010）。此外，生產(chǎn)過程中大量施用化肥導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量和孔隙度降低、容重增加，從而使耕層土壤發(fā)僵和土體板結(jié)（張俊等，2016）。土壤微生物參與土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)、轉(zhuǎn)化與循環(huán)，是根際土壤的主要分解者與調(diào)控者（樊曉剛等，2010），也是表征土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)（Fierer and Jackson，2006；Kowalchuk et al.，2007）。翻壓綠肥可為植煙土壤提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，也可提高土壤肥力和改善土壤結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改善和生物多樣性的調(diào)節(jié)有較好效果（董立國等，2010；張志明等，2012；王麗等，2014；陳乾錦等，2019）。但目前綠肥的使用具有一定局限性，不同綠肥品種的使用和翻壓方式也不明確，不同地區(qū)由于環(huán)境因素差異導(dǎo)致對(duì)綠肥的應(yīng)用范圍也較窄（傅淋等，2015），不僅影響作物根系的生長，還牽制了肥料—土壤—作物養(yǎng)分系統(tǒng)的平衡。因此，研究不同耕作深度與翻壓綠肥對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響，對(duì)煙區(qū)培肥改土及進(jìn)一步提高烤煙產(chǎn)量和質(zhì)量具有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態(tài)的指標(biāo)，可反映土壤中微生物群落的生態(tài)和土壤肥力特征（Sun et al.，2015），在綠肥—烤煙輪作中，綠肥作物可提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)（王麗等，2014；陳乾錦等，2019），改善土壤微生物多樣性和代謝功能（李勝華等，2009；董立國等，2010），有利于培肥地力、保持土壤良好結(jié)構(gòu)和強(qiáng)化農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能（Proulx et al.，2010；Mendes et al.，2013；李隆，2016）。林葉春等（2018）通過研究連續(xù)種植4年綠肥（黑麥草、燕麥、光葉紫花苕和紫云英）壓青對(duì)烤煙根際土壤細(xì)菌豐富度和多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)綠肥壓青還田可提高植煙土壤水解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量，改變土壤pH，調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。王飛等（2019）研究了翻壓不同綠肥對(duì)植煙土壤細(xì)菌類群的影響，結(jié)果表明，與無綠肥處理相比，翻壓綠肥處理可明顯提高土壤細(xì)菌的α多樣性且在旺長期能顯著降低煙草青枯病致病菌（）豐度，說明翻壓綠肥可在一定程度上改善植煙土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)。趙冬雪（2019）研究綠肥對(duì)植煙土壤微生物群落多樣性的影響，結(jié)果表明，翻壓草木犀和黑麥草的土壤微生物群落組成在群落熱圖與OTU水平的層次聚類樹較相似，小麥、紫花苜蓿與對(duì)照的土壤微生物群落組成差異較小，套作黑麥草和草木犀的植煙土壤細(xì)菌種類最多。呂卓呈等（2021）研究了冬小麥夏閑期種植翻壓綠肥作物對(duì)土壤細(xì)菌群落特征的影響，結(jié)果表明，冬小麥夏閑期種植翻壓草木樨和綠豆可有效提高旱地麥田土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性。馮慧琳等（2021）研究表明，生物炭和綠肥翻壓能提升柑橘土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度，改變根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加功能細(xì)菌屬豐度，促進(jìn)柑橘根際土壤微生態(tài)平衡和土壤健康?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究了綠肥壓青對(duì)喀斯特地區(qū)植煙土壤細(xì)菌群落特征的影響及耕作深度與翻壓綠肥對(duì)植煙土壤微生物功能多樣性及酶活性的影響（林葉春等，2018；祖韋軍等，2020）。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究不同耕作深度翻壓不同品種綠肥對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Illumina MiSeq高通量測序，系統(tǒng)分析不同耕作深度與翻壓綠肥處理間土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異，篩選適合改善貴州黃壤煙區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的綠肥品種及耕作模式，為貴州黃壤煙區(qū)培肥改土及保障優(yōu)質(zhì)生態(tài)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)于2019—2020年在貴州省煙草科學(xué)研究院福泉試驗(yàn)基地（東經(jīng)107°14′、北緯27°02′）進(jìn)行。試驗(yàn)地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，海拔1020 m，年均氣溫14 ℃，年均降水量1126.5 mm，土壤類型為黃壤。供試土壤pH為4.85、全氮含量2.07 g/kg、全磷含量1.51 g/kg、全鉀含量8.84 g/kg、水解氮含量138.76 mg/kg、有效磷含量64.64 mg/kg、速效鉀含量379.94 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量32.85 g/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試綠肥品種為黑麥草（Ryegrass）（禾本科，撒播量30 kg/ha）、光葉紫花苕（）（豆科，撒播量45 kg/ha）、油菜（Rape）（十字花科，撒播量15 kg/ha），均為市售。供試烤煙品種為云煙87。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采取兩因素多水平隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)8個(gè)大區(qū)，大區(qū)面積55.0 m×4.5 m，大區(qū)間留1.5 m寬過道，四周設(shè)保護(hù)行。綠肥于2019年11月撒播，2020年3月中旬翻壓，計(jì)劃翻壓量為22500 kg/ha；烤煙于綠肥翻壓1個(gè)月后移栽，大田施肥量為純N 97.50 kg/ha、PO67.50 kg/ha、KO 247.50 kg/ha，移栽密度16500株/ha。具體方案見表1。

1.4 樣品采集

烤煙盛花期，各處理選取3個(gè)具有代表性的樣點(diǎn)，用土鉆鉆取0～20 cm耕層煙株根際土壤，迅速去除根系、石塊等雜物后用錫箔紙包裹，裝入50 mL離心管中，立即放入液氮冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于土壤細(xì)菌多樣性分析。

1.5 測定項(xiàng)目及方法

1.5.1 綠肥生物量測定 綠肥翻壓前35 d，各大區(qū)每隔7 d隨機(jī)取綠肥1 m樣方3個(gè)，共取樣5次，分別沿地表割取地上部鮮草及挖取地下部根系，地上部收割后立即稱重計(jì)算鮮草產(chǎn)量（3個(gè)重復(fù)分別標(biāo)為A1、A2、A3），地下部根系經(jīng)清洗并瀝干水分后稱取根系鮮物質(zhì)量（3個(gè)重復(fù)分別標(biāo)為B1、B2、B3）。地上部鮮草和地下部根系于105 ℃烘箱殺青30 min后，再于50 ℃下烘干后計(jì)算干物質(zhì)量。干物質(zhì)率（%）=干物質(zhì)量/鮮物質(zhì)量×100。

地上部鮮草產(chǎn)量（kg/ha）=（A1+A2+A3）/3×10000

地上部干物質(zhì)量（kg/ha）=地上鮮草產(chǎn)量×干物質(zhì)率

地下部鮮物質(zhì)量（kg/ha）=（B1+B2+B3）/3×10000

地下部干物質(zhì)量（kg/ha）=地下部鮮物質(zhì)量×干物質(zhì)率

1.5.2 土壤DNA提取與擴(kuò)增 取保存的目標(biāo)土壤樣品，加液氮研磨后提取土壤總DNA。經(jīng)DNA濃度檢測后，利用ABI GeneAmp9700型PCR儀，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA V～V區(qū)進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物為338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase，反應(yīng)體系20.0 μL：5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，BSA 0.2 μL，10.0 ng DNA 模 板 及0.4 μL FastPfu Polymerase（TransStart FastPfu DNA Polymerase，TransGen）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s，進(jìn)行27循環(huán)，72 ℃延伸10 min，10 ℃條件下結(jié)束反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測及回收。

1.5.3 高通量測序 Miseq文庫構(gòu)建和測序均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，測序平臺(tái)為Illumina MiseqPE300/250。測序完成后，對(duì)有效序列進(jìn)行過濾優(yōu)化處理，并根據(jù)高于97%序列相似性定義OTU，對(duì)16S rRNA細(xì)菌的所有OTU序列進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

隨機(jī)抽取相似度在97%的OTU，利用Mothur（v.1.30.1）（Fouts et al.，2012）進(jìn)行Rarefaction分析，利用R語言工具制作曲線圖。利用Mothur計(jì)算ACE和Chao豐富度指數(shù)，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)?；赟ilva數(shù)據(jù)庫，對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，利用Excel和R語言工具對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行圖表制作。利用Qiime計(jì)算β多樣性距離矩陣，并進(jìn)行層次聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠肥生物量分析

由表2可知，各綠肥品種翻壓前地上部鮮草產(chǎn)量均超過計(jì)劃翻壓量22500 kg/ha，其中黑麥草、油菜和光葉紫花苕鮮草產(chǎn)量分別是計(jì)劃翻壓量的2.71、1.58和1.31倍，各綠肥鮮草產(chǎn)量分別按實(shí)際生長量清除多余部分用于飼草。地上部干物質(zhì)率表現(xiàn)為油菜＞黑麥草＞光葉紫花苕，地下部干物質(zhì)率表現(xiàn)為光葉紫花苕＞油菜＞黑麥草。說明黑麥草具有較高的地上部鮮草產(chǎn)量，但地下部干物質(zhì)率卻小于另外2種綠肥，油菜具有較高的地上部干物質(zhì)率，光葉紫花苕具有較高的地下部干物質(zhì)率。

2.2 土壤細(xì)菌16S rRNA基因測序深度分析

如圖1所示，各處理的16S rRNA讀數(shù)（reads）均超過40000，且OTUs介于2000～2500，稀釋性曲線逐漸趨于平緩，表明所有樣品的測序量達(dá)飽和，PCR擴(kuò)增的序列數(shù)可反映不同耕作深度下翻壓綠肥的煙株根際土壤細(xì)菌群落組成。

2.3 測序樣品數(shù)據(jù)質(zhì)控

如表3所示，原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，各翻壓綠肥處理煙株根際土壤樣品總序列和總堿基數(shù)均高于無綠肥對(duì)照，序列平均長度均為416 bp。

2.4 土壤細(xì)菌OTU統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

如圖2所示，淺耕模式下（圖2-A），不同處理間共有的土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量為2235個(gè)，無綠肥對(duì)照（CK1）、油菜（T1）、光葉紫花苕（T2）和黑麥草（T3）煙株根際的特有細(xì)菌種類分別為221、228、171和161個(gè)。與無綠肥對(duì)照（CK1）比較，光葉紫花苕（T2）和黑麥草（T3）減少了煙株根際特有細(xì)菌，分別下降22.62%和27.15%；油菜增加了煙株根際特有的細(xì)菌，增幅為3.17%。深耕模式下（圖2-B），不同處理間共有的土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量為2105個(gè)，無綠肥對(duì)照（CK2）、油菜（T4）、光葉紫花苕（T5）和黑麥草（T6）煙株根際的特有細(xì)菌種類分別為189、221、225和183個(gè)。與無綠肥對(duì)照（CK2）比較，油菜（T4）和光葉紫花苕（T5）翻壓增加了煙株根際特有的細(xì)菌種類，分別提升16.93%和19.05%；黑麥草（T6）減少了煙株根際土壤特有細(xì)菌，減幅為3.17%。同一綠肥不同耕作深度下，無綠肥+深耕（CK2）、光葉紫花苕+深耕（T5）和黑麥草+深耕（T6）的煙株根際土壤特有細(xì)菌種類分別較無綠肥+淺耕（CK1）、光葉紫花苕+淺耕（T2）和黑麥草+淺耕（T3）提高9.66%、19.81%和3.95%，油菜+深耕（T4）的煙株根際土壤特有的細(xì)菌種類較油菜+淺耕（T1）降低42.82%（圖2-C～圖2-F）。

通過樣品的Alpha多樣性分析可反映土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，樣品測序的相應(yīng)文庫覆蓋率在98%以上（表4）。ACE和Chao指數(shù)可反映土壤細(xì)菌群落的豐富度。由表4可知，淺耕模式下，與無綠肥對(duì)照（CK1）相比，翻壓油菜（T1）和光葉紫花苕（T2）的ACE指數(shù)分別降低7.76%和2.60%，Chao指數(shù)分別降低2.03%和2.68%，翻壓黑麥草（T3）的ACE指數(shù)提高0.31%，Chao指數(shù)提高2.99%；深耕模式下，翻壓油菜（T4）和黑麥草（T6）的ACE和Chao指數(shù)較無綠肥對(duì)照（CK2）分別降低13.45%、5.73%和12.92%、4.16%，翻壓光葉紫花苕（T5）的ACE指數(shù)較無綠肥對(duì)照（CK2）降低1.32%，但Chao指數(shù)提高1.43%。同一綠肥不同耕作深度下，無綠肥+深耕（CK2）和光葉紫花苕+深耕（T5）的ACE和Chao指數(shù)分別較無綠肥+淺耕（CK1）和光葉紫花苕+淺耕（T2）提高3.01%、4.36%和2.37%、6.69%；油菜+深耕（T4）和黑麥草+深耕（T6）的ACE和Chao指數(shù)分別較油菜+淺耕（T1）和黑麥草+淺耕（T3）降低3.35%、3.20%和9.00%、4.74%。綜合來說，與無綠肥對(duì)照比較，不同綠肥品種在不同耕作深度翻壓下調(diào)節(jié)了煙株根際土壤的細(xì)菌豐富度，其中以深耕翻壓光葉紫花苕模式綜合效果較好。Shannon指數(shù)可反映土壤細(xì)菌群落的多樣性（Schloss et al.，2011）。由表4還可看出，淺耕模式下，翻壓油菜（T1）和黑麥草（T3）的Shannon指數(shù)較無綠肥對(duì)照（CK1）分別降低0.46%和0.34%，翻壓光葉紫花苕（T2）的Shannon指數(shù)分別較無綠肥對(duì)照（CK1）提高0.80%；深耕模式下，翻壓油菜（T4）的Shannon指數(shù)較無綠肥對(duì)照（CK2）降低2.60%，翻壓光葉紫花苕（T5）較無綠肥對(duì)照（CK2）提高0.79%，翻壓黑麥草（T6）的Shannon指數(shù)較無綠肥對(duì)照（CK2）提高0.57%；同一綠肥不同耕作深度下，無綠肥+深耕（CK2）、光葉紫花苕+深耕（T5）和黑麥草+深耕（T6）的Shannon指數(shù)分別較無綠肥+淺耕（CK1）、光葉紫花苕+淺耕（T2）和黑麥草+深耕（T3）提高1.61%、1.60%和2.54%，但油菜+深耕（T4）的Shannon指數(shù)較油菜+淺耕（T1）降低0.58%。綜合來說，與無綠肥對(duì)照比較，深耕翻壓光葉紫花苕和黑麥草更能有效提高煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性。

2.5 土壤細(xì)菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

如表5所示，不同耕作深度翻壓綠肥后細(xì)菌各類水平種數(shù)較無綠肥對(duì)照均有變化。淺耕模式下，翻壓油菜（T1）煙株根際土壤細(xì)菌增加8個(gè)屬，翻壓光葉紫花苕（T2）煙株根際土壤細(xì)菌增加2個(gè)目、1個(gè)科、14個(gè)屬，翻壓黑麥草（T3）煙株根際土壤細(xì)菌增加3個(gè)科、6個(gè)種；深耕模式下，翻壓油菜（T4）和黑麥草（T6）煙株根際土壤細(xì)菌均增加1個(gè)門、1個(gè)綱，翻壓光葉紫花苕（T5）煙株根際土壤細(xì)菌增加2個(gè)門、3個(gè)綱；同一綠肥品種深耕較淺耕相比，翻壓光葉紫花苕煙株根際土壤細(xì)菌增加1個(gè)門、1個(gè)綱、1個(gè)目、10個(gè)屬、18個(gè)種、103個(gè)OTU，其余處理均有降低趨勢。說明不同耕作深度翻壓綠肥后煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均有所改變，翻壓光葉紫花苕處理變化最顯著。

如圖3所示，門水平樣品細(xì)菌群落相對(duì)豐度結(jié)果表明，淺耕模式（T1、T2、T3和CK1）下根際土壤中前4種主要細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria）（44.22%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（22.85%）、放線菌門（Actinobacteria）（7.08%）和綠彎菌門（Chloroflexi）（7.67%）；深耕模式（T4、T5、T6和CK2）下前4種主要細(xì)菌也為變形菌門（45.38%）、酸桿菌門（21.26%）、放線菌門（7.17%）和綠彎菌門（7.56%）。綜合來看，與無綠肥對(duì)照比較，翻壓綠肥處理變形菌門和酸桿菌門平均豐度分別提高0.23%和4.44%，放線菌門和綠彎菌門分別降低1.34%和1.55%。

如圖4所示，屬水平樣品細(xì)菌群落相對(duì)豐度結(jié)果表明，各處理淺耕模式（T1、T2、T3和CK1）下平均相對(duì)豐度大于1%的屬有鞘氨醇單胞菌屬（）（6.78%）、朱式桿菌屬（）（2.34%）、待定革蘭蛋白桿菌屬（unidentified_）（4.57%）、產(chǎn)黃桿菌屬（）（2.71%）、待定伯克氏菌屬（unidentified_）（1.69%）、苔蘚桿菌屬（）（2.77%）、_（1.79%）、芽單胞菌屬（）（2.10%）、（1.93%）和鞘脂菌屬（）（1.25%）；深耕模式下（T4、T5、T6和CK2）相對(duì)豐度大于1%的屬有鞘氨醇單胞菌屬（6.81%）、朱式桿菌屬（3.08%）、待定革蘭蛋白桿菌屬（4.20%）、產(chǎn)黃桿菌屬（2.76%）、待定伯克氏菌屬（1.72%）、苔蘚桿菌屬（2.52%）、勞爾氏菌屬（）（1.09%）、（1.46%）、芽單胞菌屬（1.94%）、（1.83%）和鞘脂菌屬（1.26%）。綜合來看，與淺耕比較，深耕翻壓綠肥處理鞘氨醇單胞菌屬、朱式桿菌屬、產(chǎn)黃桿菌屬和待定伯克氏菌屬平均豐度分別提高0.03%、0.74%、0.05%和0.03%，待定革蘭蛋白桿菌屬、苔蘚桿菌屬和芽單胞菌屬分別降低0.37%、0.25%和0.16%，新增加了勞爾氏菌屬。

所有檢測樣品中細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度熱圖（圖5）顯示，各處理間土壤樣品細(xì)菌分布存在一定差異。淺耕模式下，翻壓油菜（T1）具有的優(yōu)勢菌群為溶桿菌（），黑麥草（T3）具有的優(yōu)勢菌群為、待定棒狀桿菌（unidentified_），其相對(duì)豐度均高于其余細(xì)菌屬，而翻壓光葉紫花苕（T2）與無綠肥對(duì)照（CK1）土壤樣品中各細(xì)菌屬分布較均勻；深耕模式下，翻壓油菜（T4）具有的優(yōu)勢菌群為代爾夫特菌（）、無色桿菌（）、腸桿菌（），翻壓光葉紫花苕（T5）的優(yōu)勢菌群為黃桿菌（）、芽孢桿菌（）和假單胞菌（），翻壓黑麥草（T6）的優(yōu)勢菌群為狄氏桿菌（），無綠肥對(duì)照（CK2）的優(yōu)勢菌群為假桿菌（）和鞘氨醇桿菌（），各優(yōu)勢菌屬相對(duì)豐度均高于其余細(xì)菌屬。

由圖6可看出，基于土壤細(xì)菌種類豐度分析結(jié)果，在屬水平上進(jìn)行物種分類樹統(tǒng)計(jì)，不同耕作深度翻壓綠肥土壤中的微生物的種類比例存在明顯差異。其中，放線菌門（Actinobacteria）主要集中在黑麥草+淺耕（T3）樣品中，厚壁菌門（Firmicutes）主要集中在光葉紫花苕+深耕（T5）樣品中，均達(dá)95%以上；油菜+深耕（T4）在變形菌門上γ-變形菌亞門（Gammaproteobacteria）所占比例最大，變形菌門的腸桿菌屬（）比例在所有檢測樣品中最高，達(dá)50%以上。

2.6 不同處理細(xì)菌進(jìn)化分支圖分析

由圖7可知，不同耕作深度翻壓綠肥對(duì)煙田土壤細(xì)菌進(jìn)化分支有不同影響，從門至屬的分類級(jí)別由輻射的圓圈內(nèi)至圓圈外，黃圈表示無顯著差異且物種所占比例較高，與之相比各處理中體現(xiàn)各自差異的微生物類群較少。淺耕模式下，如圖7-A所示，只有T1處理與各處理間差異顯著，起重要作用的細(xì)菌在綱水平為α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）；目水平為鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）；科水平為鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）。深耕模式下，如圖7-B所示，各處理間均有差異，T4處理起重要作用的細(xì)菌在綱水平為α-變形桿菌綱，T5處理起重要作用的細(xì)菌在科水平為芽胞桿菌科（Bacillaceae），T6處理起重要作用的細(xì)菌在目水平為酸桿菌目（Acidobacteriales），CK2處理起重要作用的細(xì)菌在目水平為黃單胞菌目（Xanthomonadales），科水平為羅丹桿菌科（Rhodanobacteraceae）。說明深耕模式更能有效增加土壤細(xì)菌優(yōu)勢種群，各處理間起重要作用的細(xì)菌主要集中在綱、目、科3個(gè)水平上。

3 討論

本研究以無綠肥翻壓煙株根際土壤為對(duì)照，利用Illumina MiseqPE300/250高通量測序平臺(tái)，分析2種耕作深度下翻壓3個(gè)綠肥品種煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，結(jié)果顯示各處理的16S rRNA讀數(shù)均超過40000，且OTUs在2000～2500，稀釋性曲線逐漸趨于平緩，表明所有樣品的測序量達(dá)飽和。由ACE和Chao指數(shù)可知，耕作深度與翻壓綠肥處理有利于增加煙株根際土壤細(xì)菌豐富度，與張向前等（2012）、李伶俐等（2019）研究指出的綠肥翻壓有利于增加土壤細(xì)菌微生物數(shù)量的結(jié)果一致，其原因可能與綠肥翻壓導(dǎo)致植煙土壤中有機(jī)碳和氮源增加，從而促進(jìn)土壤細(xì)菌生長和繁殖有關(guān)。此外，淺耕模式下，翻壓油菜和黑麥草的Shannon指數(shù)低于無綠肥對(duì)照，翻壓光葉紫花苕高于無綠肥對(duì)照；深耕模式下，翻壓油菜的Shannon指數(shù)低于無綠肥對(duì)照，翻壓光葉紫花苕和黑麥草高于無綠肥對(duì)照。綜合來說，與無綠肥對(duì)照比較，深耕條件下翻壓光葉紫花苕和黑麥草更能有效提高煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性，與林葉春等（2018）研究指出的綠肥壓青后土壤多樣性指數(shù)較無綠肥對(duì)照有所降低的結(jié)果不一致，其原因可能與耕作深度不同導(dǎo)致耕層土壤質(zhì)量不同有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步探究。

本研究中，與無綠肥對(duì)照比較，翻壓綠肥處理會(huì)增加煙株根際土壤特有細(xì)菌種類，其中，綠肥翻壓處理變形菌門和酸桿菌門平均豐度分別提高0.23%和4.44%，放線菌門和綠彎菌門分別降低1.34%和1.55%。土壤功能微生物的數(shù)量可直接表征土壤營養(yǎng)轉(zhuǎn)化及抗病能力（Chen et al.，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門主要集中在光葉紫花苕+深耕樣品中，達(dá)95%以上。很多厚壁菌可產(chǎn)生芽孢，可抵抗脫水和極端環(huán)境，減輕天氣災(zāi)害對(duì)土壤的沖擊，與相關(guān)研究（林葉春等，2018；劉艷霞等，2018；陳懿等，2019；謝紅煉等，2020）的結(jié)果一致。門水平上，本研究深耕模式的變形菌門和放線菌門比例較淺耕模式提高，酸桿菌門和綠彎菌門比例降低。放線菌門中包含許多可產(chǎn)抗生素、有機(jī)酸和酶等的細(xì)菌，其含量可作為土壤健康狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)（Bhatti et al.，2017；向立剛等，2019），放線菌門比例提高說明深耕模式可在一定程度上改善土壤質(zhì)量。屬水平上，本研究所有樣品中均有勞爾氏菌屬存在。勞爾氏菌為煙草青枯病病原菌，表明所采集的淺耕與深耕土壤均攜帶有青枯病菌。深耕模式下煙株根際土壤勞爾氏菌屬相對(duì)豐度大于淺耕模式，推測淺耕模式下土壤勞爾氏菌可能為弱致病力菌株，深耕模式下可能由于耕層和綠肥的改變和翻壓，土壤或綠肥自身攜帶的病原菌導(dǎo)致勞爾氏菌相對(duì)豐度增加。

本研究通過LEfSe進(jìn)化分支圖發(fā)現(xiàn)，除油菜+淺耕外，深耕較淺耕模式更能有效增加土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群，且深耕模式下各綠肥處理中只有翻壓光葉紫花苕在科水平上有優(yōu)勢種群，為桿菌科，能有效分解土壤養(yǎng)分，各處理間起重要作用的細(xì)菌主要集中在綱、目、科3個(gè)水平上。該結(jié)果與蔣雨洲等（2019）研究指出稻草還田或增施餅肥的煙田在細(xì)菌類群上顯著差異，且主要集中在綱、目、科水平上的結(jié)果基本一致。深耕模式下的土壤微生物群落與光葉紫花苕之間互作效果良好，增加了土壤微生物的豐富度和多樣性，改善了土壤環(huán)境。有研究表明烤煙與其他作物的輪作系統(tǒng)在大批化學(xué)殺蟲劑被禁用的情況下還能有效預(yù)防蟲害及提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量（金娜等，2015；閆芳芳等，2018；張宗錦等，2019），但植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與烤煙產(chǎn)量和質(zhì)量及土傳病害間的相互關(guān)系較復(fù)雜，尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

不同耕作深度翻壓綠肥調(diào)節(jié)了煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，根際土壤微生物的OTUs數(shù)量差異明顯，總體呈現(xiàn)出各翻壓綠肥處理高于無綠肥對(duì)照，深耕高于淺耕。除油菜+淺耕外，深耕模式更能有效增加土壤細(xì)菌優(yōu)勢種群，且深耕模式下各翻壓綠肥處理間只有光葉紫花苕在科水平上有桿菌科優(yōu)勢菌群，各處理間起重要作用的細(xì)菌主要集中在綱、目、科3個(gè)水平上?？傮w以光葉紫花苕+深耕模式在改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上效果較佳，可作為貴州福泉黃壤煙區(qū)有效的栽培與耕作方式推廣應(yīng)用。