人體微生物與健康及其在法醫(yī)鑒定中的新探索

摘 要 人體微生物群落是一個龐大而華麗的大家族，在平衡人體健康中扮演著重要的角色，另外，隨著新一代測序技術(shù)以及宏基因組學(xué)研究的不斷發(fā)展與深入，一方面微生物與人體之間交流機(jī)制進(jìn)一步得到闡釋，另一方面利用人體微生物群落進(jìn)行法醫(yī)鑒定也有了新的發(fā)現(xiàn)，本文對人體微生物與健康，在法醫(yī)鑒定中的新探索，以及新技術(shù)進(jìn)展包括焦磷酸測序、宏基因組研究等進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 人體微生物；焦磷酸測序；宏基因組；法醫(yī)鑒定

中圖分類號 R714 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1673-9671-(2012)052-0120-02

從19世紀(jì)初的談菌色變，到人類運用抗生素、疫苗等醫(yī)療手段來遏制微生物對人體所帶來的疾病，再到近年來專注于人體微生物的各項研究，不斷運用新的科學(xué)技術(shù)闡釋人體微生物在維持人體健康中的重要作用。2007年美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）出資1.5億美元正式啟動“人類微生物研究計劃”（HMP），旨在揭示人體健康、疾病狀態(tài)與人體微生物之間的關(guān)系，另外，通過宏基因組學(xué)方法和新一代測序方法的相互作用，HMP將為進(jìn)一步研究人體相關(guān)微生物群落奠定堅實的基礎(chǔ)。

科學(xué)研究者的思維是縝密且發(fā)散的，在研究人體微生物維持人體健康的同時，任何新的發(fā)現(xiàn)都會有著科學(xué)的新思考，2010年，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的研究團(tuán)隊通過人體皮膚微生物研究報道了其與法醫(yī)鑒定之間的新發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人觸摸物體時，會在物體表面留下手上的細(xì)菌，而研究結(jié)果證實這些細(xì)菌卻是獨一無二的，細(xì)菌的個體差異性相當(dāng)顯著，那么一定程度上就可像指紋那樣用于身份識別。

1 人體微生物影響人體健康

人體正常微生物群是指棲息在人體皮膚或粘膜上并伴隨宿主長期進(jìn)化而形成的微生物群落。人體內(nèi)部或體表活躍著超過200萬億個（約是人體細(xì)胞總數(shù)的十倍），總重量超過1千克（占人體總身體質(zhì)量的1%～2%）的微生物個體，包括細(xì)菌、真菌和病毒等。微生物的生長需要特定環(huán)境，生理上近似的部位寄生的微生物也大致相同，而環(huán)境條件差異較大的區(qū)域，則生活著截然不同的菌群。健康的人體微生物群落在維持機(jī)體生物、化學(xué)、免疫屏障以及對宿主營養(yǎng)、健康、抵御致病微生物侵襲、抗腫瘤、抗衰老等方面發(fā)揮著重要的生理作用。當(dāng)然，并非人體所有微生物都是有益的，我們知道，初生嬰兒在分娩前體內(nèi)是沒有微生物的，此時嬰兒的免疫系統(tǒng)尚不健全，根據(jù)最近美國一項研究表明，產(chǎn)道分娩和剖腹產(chǎn)的嬰兒出生后所攜帶的微生物群落是不一樣的，前者攜帶的細(xì)菌和母親陰道里的微生物匹配，而后者攜帶的則是常見的皮膚微生物，這些微生物一方面在體內(nèi)繁衍，另一方面幫助嬰兒塑造免疫系統(tǒng)，但就在建立免疫系統(tǒng)的同時，一些有害菌則趁機(jī)而入，此時則需要發(fā)生激烈的斗爭，健康菌群會戰(zhàn)勝有害菌群，而那些生下來就體弱多病的嬰兒很大程度上是由于攜帶了不夠強(qiáng)大的健康菌群，所以孕婦陰道微生物構(gòu)造與嬰兒的初始微生物群落有很大關(guān)聯(lián)。有些早產(chǎn)嬰兒很容易受到胃腸道細(xì)菌的感染進(jìn)而導(dǎo)致敗血癥、慢性腹瀉和壞死性腸炎，當(dāng)嬰兒長到6個月大時，從開始在產(chǎn)道中攜帶著100種微生物到獲得約700種微生物，到3歲時，每個孩子的身上微生物群構(gòu)成和自身基因組一樣，都是獨一無二的，而每套成熟的微生物基因組也同時發(fā)揮著不可或缺的作用，增強(qiáng)了抵御外界環(huán)境病原菌侵襲的能力，維持健康，促進(jìn)生長發(fā)育。

人體微生物影響著人體健康，共生菌能誘導(dǎo)產(chǎn)生某一免疫細(xì)胞，支持著人體的免疫系統(tǒng)，體內(nèi)豐富的Faecalibacterium prausnitzi菌具有抗炎癥作用，可以抵抗克羅恩病的復(fù)發(fā)，Bacteroides fragilis菌能夠防止老鼠患結(jié)腸炎。根據(jù)06年在《自然》雜志上的一則報道，尼科爾森小組對同一種遺傳品系的小鼠進(jìn)行了喂藥實驗，在服食高劑量同種藥物后，其中一組小鼠出現(xiàn)了肝中毒癥狀，而另一組小鼠則安然無恙。因為通過腸道微生物產(chǎn)生的尿液代謝物檢測可以區(qū)分遺傳特性高相似度的個體，所以得出結(jié)論，未中毒的小鼠腸道里的特定微生物群落將藥物毒性進(jìn)行了分解，從而保護(hù)了宿主。最近，此研究團(tuán)隊同樣在《自然》雜志上報道了高血壓與腸道菌群的組成具有密切的關(guān)系。不僅如此，戈登小組06年在《自然》雜志上同時報道了腸道微生物產(chǎn)生的某種因子很有可能是機(jī)體啟動肥胖的必需物質(zhì)。吉布森小組07年在《糖尿病》上報道了高脂食物顯著減少了保護(hù)腸道屏障的有益菌如雙歧桿菌，明顯增加了可產(chǎn)生內(nèi)毒素的細(xì)菌數(shù)量，導(dǎo)致進(jìn)入血液的內(nèi)毒素增加，最終導(dǎo)致一系列代謝紊亂疾病。人體結(jié)構(gòu)異常的腸道菌群很可能是肥胖、高血壓、糖尿病等因飲食結(jié)構(gòu)不當(dāng)造成的代謝性疾病的直接誘因。另外，有益菌補給是近年來宣傳改善機(jī)體健康最為火熱的一部分，但目前還沒有確鑿的科學(xué)證據(jù)顯示益生菌補充劑或是含有益生菌的食物對健康的人有益，由于不同個體微生物群落存在差異，同樣的攝入不一定有著同樣的效果，有益有害，難以定論，當(dāng)然，如果機(jī)體本身就有營養(yǎng)不良或者消化不良的癥狀，體內(nèi)有益微生物群落的優(yōu)勢必然大大削弱，影響身體的健康。對于個體來說，精良健康的體內(nèi)微生物群落會像一個清潔工，掃除體內(nèi)的各種代謝垃圾，也像一臺動力十足的馬達(dá)，充分吸取營養(yǎng)物質(zhì)精華，保持活力，提高新陳代謝能力。

近年來，基因組學(xué)的高速發(fā)展使我們能更準(zhǔn)確高效的獲得人體微生物的信息，在過去的5年里，美國國家衛(wèi)生研究院的“人體微生物研究計劃”和歐盟的“人類腸道宏基因組計劃”已得到階段性的實施，其研究思路都采用了新一代基因測序技術(shù)與宏基因組技術(shù)相結(jié)合的方式來探索人體微生物多樣性對人體健康的影響，但技術(shù)的發(fā)展暫時還不能滿足科學(xué)研究的迫切需要，目前的測序技術(shù)能力還不能識別全部的人體微生物群落，下面主要介紹人體微生物研究新技術(shù)的一些進(jìn)展。

2 人體微生物研究新技術(shù)進(jìn)展

2.1 16sRNA-識別微生物遺傳信息的獨特指紋

微生物rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。5S rRNA基因較短，呈現(xiàn)微生物多態(tài)性位點較少，而23S rRNA則較長，無法順利進(jìn)行測序，而16S rRNA長度適中約1500個nt，包含足夠的遺傳信息，且在所有的細(xì)菌中都存在，有8處高度保守區(qū)和9處可變區(qū)域，保守區(qū)序列有助于設(shè)計測序引物，而可變區(qū)序列用于分析種屬關(guān)系，為鑒定與分類提供了便利，所以16S rRNA是微生物群落分析，進(jìn)化及分類研究最常用的靶分子。通常情況下，實驗時一般提取微生物DNA進(jìn)行后續(xù)工作，因為rDNA是rRNA分子的對應(yīng)的DNA序列，也就是編碼16S rRNA的基因，DNA提取容易，也比較穩(wěn)定，將測序完的16S rDNA序列信息上傳到數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析，序列相似性在98%以上的可以認(rèn)為是同種，97%以上可以認(rèn)為是同屬，小于96%～97%的可以認(rèn)為是不同種，小于93%～95%的可以認(rèn)為是不同屬。但比對出來的信息都是數(shù)據(jù)庫中已有的物種信息，針對一些未知的或未發(fā)現(xiàn)的菌則無法檢測出來。

2.2 焦磷酸測序技術(shù)

繼sanger測序法之后，目前最為重要的測序技術(shù)就是焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing），其核心是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，這4種酶分別為：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為5′-磷酰硫酸、熒光素，反應(yīng)體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)。焦磷酸基團(tuán)可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由焦磷酸測序儀器轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目是成正比的。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。焦磷酸測序技術(shù)的建立與應(yīng)用使得高通量準(zhǔn)確測定特征序列、有效進(jìn)行微生物的分型鑒定成為可能。

2.3 宏基因組學(xué)研究

宏基因組（metagenome），指環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物的基因總和，由Handelsman等1998年提出。而宏基因組學(xué)（metagenomics）是一種直接對無需培養(yǎng)的微生物多樣性進(jìn)行研究的方法，該方法直接提取特定環(huán)境中全部微生物的總基因組，并克隆到合適的可培養(yǎng)微生物宿主中，從而真實地反映該環(huán)境中微生物的多樣性資料。簡單地說，宏基因與16S rRNA有著顯著的區(qū)別，宏基因針對整個環(huán)境中的所有微生物基因，為了檢測環(huán)境中有哪些基因，而16S針對的是物種所屬。宏基因組學(xué)的基本方法是分析微生物環(huán)境中的基因組組合，直接分離未培養(yǎng)微生物基因組DNA，將其克隆到可培養(yǎng)的微生物中，最后篩選出所需的。宏基因組學(xué)方法可以得到

16S rRNA的序列，但在確定細(xì)菌種屬問題上的準(zhǔn)確性不如特定用16S rRNA方法高。

3 人體微生物在法醫(yī)鑒定中的新探索

21世紀(jì)末，法庭科學(xué)中作為生物物證之一的微生物物證檢驗逐漸興起，微生物物證主要為細(xì)菌、病毒、真菌等可能涉及犯罪的微生物，其種類可分為三種：1）作為恐怖的生物武器，通過美國“911”之后的炭疽桿菌信件攻擊事件，我們可以清楚的看到此類微生物制劑的非法傳播將導(dǎo)致極為嚴(yán)重的后果；2）作為生物犯罪手段，生物犯罪是指故意使用致病微生物導(dǎo)致人、動物和植物發(fā)病，威脅人類健康，破壞農(nóng)畜牧業(yè)發(fā)展和食品安全的犯罪行為，如艾滋病人故意傳播艾滋病毒，導(dǎo)致他人患病等；3）作為犯罪的見證者，即微生物物證可在案犯實施犯罪過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移，將現(xiàn)場特定微生物與罪犯攜帶的部分相同現(xiàn)場微生物進(jìn)行比對分析，可將嫌疑人與犯罪建立聯(lián)系。

隨著人體微生物研究的深入，一定程度上人體微生物扮演著犯罪見證者的角色。人的皮膚上生活著許多微生物，有細(xì)菌也有真菌，維持它們生存的營養(yǎng)物質(zhì)便是人體汗液中的無機(jī)離子和有機(jī)物，平均每平方厘米的干燥皮膚上有1千個細(xì)菌，濕潤的地方甚至多達(dá)1百萬個，皮膚上的微生物容易被水洗脫，但洗脫后的8小時內(nèi)又會迅速恢復(fù)到之前的正常穩(wěn)定狀態(tài)。2010年美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的一個研究小組做了這樣一個實驗，他們用無菌棉棒從3臺電腦的鍵盤上提取到表面細(xì)菌，抽取細(xì)菌DNA后進(jìn)行了焦磷酸測序，序列遞交數(shù)據(jù)庫比對后確定細(xì)菌種類，然后將被調(diào)查者的手上細(xì)菌進(jìn)行同樣處理，序列比對分析后，他們成功地找到了電腦的主人。另一實驗中，研究人員同樣提取了9個鼠標(biāo)上的細(xì)菌，也成功地找到了其使用者。并且，在和人類手掌微生物數(shù)據(jù)庫中的270份樣品進(jìn)行比較后，研究者發(fā)現(xiàn)鼠標(biāo)上的細(xì)菌菌群樣本更接近其使用者，另外，根據(jù)研究結(jié)果，研究者提出，每個人手掌微生物在承載客體上留下印記后，在室溫下可保留兩周，期間對承載客體上的微生物進(jìn)行測序分析，和人手掌上的微生物相一致，這種細(xì)菌指紋可以將單獨的個體從群體中分辨出來，并且不會出現(xiàn)誤判的問題，利用個體的皮膚微生物群落存在顯著差異性可以進(jìn)行法醫(yī)鑒定。細(xì)菌指紋相對于DNA指紋來說也有它的優(yōu)勢：一是在現(xiàn)場無法找到可以進(jìn)行DNA鑒定的物質(zhì)時，細(xì)菌取得較為方便；二是細(xì)菌作為人體第二套基因組，并沒有泄露被檢測人員自己的基因信息，符合法律和道德；三是作為一種新的鑒定方法，可對其他鑒定方法比如指紋鑒定做側(cè)面的論證，其鑒定結(jié)果在一定程度上更加可靠可信。

4 結(jié)語和展望

綜上所述，我們較為深刻地了解到人體微生物和人體健康有著密不可分的聯(lián)系，很多疾病包括身體機(jī)能下降都和自身微生物群落失調(diào)有關(guān)，如何進(jìn)一步建立一套完整的科學(xué)體系對人體微生物加以深入研究，留給了科學(xué)工作者更多更廣泛的研究空間，另外，隨著測序技術(shù)的不斷成熟，測序成本不斷降低，更多的基因信息終將浮出水面，目前難以解釋的科學(xué)問題到時也會迎刃而解，但科學(xué)無止境，科學(xué)的發(fā)展總是在不斷摸索的道路上前進(jìn)的，期待有一天，通過科學(xué)調(diào)理自身微生物群落，我們的食欲會大增，吸收能力增強(qiáng)，不會過于肥胖或消瘦，保持健康的身體，精力充沛，遠(yuǎn)離亞健康。當(dāng)然，在不久的將來，人體微生物作為新型的破案利器，我們不僅可以通過它找到罪犯，還可以通過現(xiàn)場遺留的微生物知道嫌疑人更多的身體秘密，比如他的生活習(xí)慣，身體健康程度等等，而這個秘密的告發(fā)者就是他自己，因為從出生那一刻起，微生物便要和他共度一生，形影不離。

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作者簡介

徐超（1985—），男，上海師范大學(xué)碩士研究生。

鞠冠華（1988—），女，上海師范大學(xué)碩士研究生。

張書（1988—），女，上海師范大學(xué)碩士研究生。