HucMSC-ex通過Let-7b調控TGF-βR1抑制肝星狀細胞膠原合成

蔡夢潔， 錢嘉莉， 陳逸菲， 王巖金， 趙婷， 劉錦文， 沈松， 嚴永敏

(江蘇大學1. 醫(yī)學院， 2. 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

我國慢性肝病患者約2 000萬，其中25%～40%最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1-2]。防治和逆轉肝纖維化是延緩或阻止肝硬化和肝癌發(fā)生的重要手段，迄今，尚無治療肝纖維化的理想藥物。肝纖維化的主要發(fā)生機制是肝內肌成纖維細胞大量合成細胞外基質，導致細胞外基質合成與降解失衡。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化是肌成纖維細胞的主要來源，并伴隨著miRNAs的變化[3-4]。調節(jié)miRNAs的表達可抑制HSC的活化，阻斷甚至逆轉肝纖維化。

外泌體(exosome)是一種直徑30～100 nm，由細胞內多胞體與胞膜融合后分泌到細胞外環(huán)境中的非可溶性膜性囊泡。外泌體攜帶其來源細胞的遺傳信息(蛋白或mRNA、miRNA)，通過受體結合、胞吞、胞膜融合等方式進入靶細胞，在組織損傷修復、免疫調節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質干細胞分泌的外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosome, HucMSC-ex)能夠抑制HSC的活化和肝組織纖維化[5]，但其具體機制尚不明確。研究表明，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信號通路與HSC活化及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關[6]，TGF-β1受體1(TGF-βR1)啟動子區(qū)域含有miRNA分子Let-7b的結合位點[7]。由此推測，HuMSC-ex可能通過轉運Let-7b下調HSC中TGF-βR1表達，從而抑制HSC活化和膠原合成。本研究擬采用TGF-β1誘導的HSC活化細胞模型，觀察HucMSC-ex對HSC膠原合成的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

LX-2細胞株(上海信裕生物科技有限公司)；H-DMEM、α-DMEM、FBS、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；ExoQuick 外泌體試劑盒(美國SBI公司)；蛋白酶抑制劑(德國CST公司)；兔抗人β-肌動蛋白多克隆抗體、兔抗人CD9多克隆抗體、小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(美國bioworld)；小鼠抗人CD63單克隆抗體(德國Millipore公司)；小鼠抗人TGF-βR1單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記羊抗兔/鼠二抗(CWBIO公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒(德國QIAGEN公司)；Let-7b模擬物(吉瑪基因有限公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司)；100Kda MW CO超濾離心管(MBI公司)；熒光定量PCR儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；ImageQuant LAS4000mini化學發(fā)光成像儀(日本GE公司)；倒置式生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 HucMSC-ex分離提取

根據(jù)本實驗室已建立的方法[5]分離HucMSC，采用含10% FBS的α-DMEM，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，所有臍帶來源于2016年10月鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院知情同意的健康孕婦。根據(jù)外泌體提取試劑盒說明，收集HucMSC培養(yǎng)上清液，超濾離心管4 ℃以1 000×g離心30 min，收集濃縮液；0.22 mm濾器過濾除菌后，加入沉淀液(濃縮液 ∶沉淀液=5 ∶1)，充分混勻后，4 ℃孵育過夜(>12 h)；次日，4 ℃以1 500×g離心30 min，棄上清液，PBS重懸沉淀獲得HucMSC-ex，分裝凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LX-2細胞株培養(yǎng)、分組及Let-7b轉染

LX-2細胞株采用含10% FBS的H-DMEM，于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的LX-2細胞株以1.25×105/mL密度接種于6孔板，分別加入濃度為25、50、100 μg/mL HucMSC-ex，另設對照組，常規(guī)培養(yǎng)，作用48 h后收集細胞，進行蛋白質和RNA分析。

另取處于對數(shù)生長期的LX-2細胞株，接種于6孔板，分別轉染隨機miRNA序列(對照組)和轉染50、100 nmol/mL Let-7b模擬物(模擬物組)。采用Lipofectamine 2000按操作說明進行細胞轉染，轉染6 h后更換含有10% FBS的完全培養(yǎng)基；48 h后收集細胞進行蛋白質和RNA分析。

1.4 qRT-PCR檢測Col1、Col3、TGF-βR1和Let-7b等mRNA表達

按Trizol試劑操作說明提取LX-2細胞株總RNA，核酸蛋白檢測儀測定濃度，取D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0之間的RNA樣品，瓊脂糖凝膠電泳鑒定質量好的RNA標本進行反轉錄，按試劑盒說明書操作合成cDNA。PCR反應體系為2×SYBR Green Super混合物10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL和0.1% DEPC水8 μL。PCR循環(huán)參數(shù)如下，Col1、Col3、TGF-βR1及β-肌動蛋白mRNA檢測：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s并采集熒光信號，35個循環(huán)；Let7b mRNA檢測：95 ℃預變性15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s (Let7b及U6)，63 ℃ 30 s并采集熒光信號，40個循環(huán)。每個樣本重復測定3 次。使用StepOneTM軟件進行熔解曲線分析，Col1、Col3、TGF-βR1檢測以β-肌動蛋白為內參基因，Let-7b檢測以U6為內參基因，采用相對定量 2-△△Ct法分析結果。

1.5 蛋白質印跡法檢測CD9、CD63、TGF-βR1和α-SMA的表達

根據(jù)細胞數(shù)目大小，加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，超聲法常規(guī)裂解細胞，于4 ℃以15 000×g離心15 min，去除沉淀，獲得細胞蛋白樣品；HucMSC-ex等體積加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，渦旋振蕩1 min，冰上靜置10 min，重復振蕩和靜置3次，獲得HucMSC-ex蛋白樣品。根據(jù)BCA試劑盒說明，繪制標準曲線并檢測細胞及HucMSC-ex蛋白濃度。樣品中加入蛋白上樣緩沖液，混勻煮沸10 min。10% SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；孵育兔抗人一抗CD9(1 ∶500)、小鼠抗人CD63(1 ∶500)、小鼠抗人TGF-βR1(1 ∶1 000)、小鼠抗人α-SMA(1 ∶1 000)、兔抗人β-肌動蛋白(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次5 min；HRP標記羊抗兔/羊抗鼠二抗(1 ∶3 000)室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，每次5 min；洗滌后采用化學發(fā)光成像儀進行成像分析。

1.6 Let-7b的靶基因預測

采用TargetScanHuman軟件(Release 7.2版本: 2018年3月)，根據(jù)軟件操作說明在線預測Let-7b的靶基因。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HucMSC-ex的鑒定

透射電鏡觀察結果顯示，提取的HucMSC-ex為球形膜性小囊泡，胞膜結構完整，直徑為30～100 nm。蛋白質印跡法結果顯示，HucMSC-ex表達外泌體標志分子CD9、CD63。見圖1。

A：透射電鏡觀察HucMSC-ex的形態(tài)；B：蛋白質印跡檢測結果，1和2分別為提取的2批HucMSC-ex

圖1HucMSC-ex的鑒定

2.2 HucMSC-ex抑制HSC膠原合成

qRT-PCR檢測結果顯示，4組LX-2細胞中Col1、Col3 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)；與對照組相比，25、50、100 μg組Col1、Col3 mRNA表達均明顯降低(P均<0.01)。由此表明，HucMSC-ex可顯著抑制LX-2細胞膠原蛋白合成。見圖2。

a：P<0.01

2.3 HucMSC-ex抑制LX-2細胞TGF-βR1表達

與對照組相比，25、50、100 μg處理組TGF-βR1mRNA表達均明顯降低(P均<0.01)。蛋白質印跡法檢測也證實，HucMSC-ex處理后，細胞中TGF-βR1表達明顯降低(P<0.01)，其中100 μg組TGF-βR1表達降低最顯著。由此表明，HucMSC-ex可下調TGF-βR1的表達。見圖3。

2.4 HucMSC-ex通過Let-7b調控TGF-βR1表達

由圖4可見，25、50、100 μg HucMSC-ex處理組中Let-7b表達均顯著高于對照組，而TGF-βRimRNA表達顯著低于對照組(P<0.01)，其中50 μg組作用最顯著，提示HucMSC-ex呈劑量依賴性地促進Let-7b表達。由圖5可見，與對照組相比，LX-2 過表達Let-7b后TGF-βR1和α-SMA表達顯著下調(P均<0.05)，且Let-7b濃度越高，對TGF-βR1和α-SMA的下調作用越明顯。上述結果初步證實，HucMSC-ex可能通過轉運Let-7b調控TGF-βR1，抑制肝星狀細胞活化。

a：P<0.01

a：P<0.01； b:P<0.05

a：P<0.01

3 討論

肝纖維化是機體對各種病理因素造成組織損傷的一種修復反應，是肝硬化和肝癌的前期必經過程。肝星狀細胞的活化、MMPs/TIMPs失衡和TGF-β信號通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的3個關鍵因素。HucMSC-ex因取材便捷、低免疫原性和無道德倫理約束等優(yōu)點而應用廣泛。本研究結果顯示，HucMSC-ex能夠體外抑制HSC活化，降低LX-2細胞中Col1和Col3的表達，與前期研究結果一致[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，胎盤絨毛膜MSC來源的外泌體能夠轉運miR-125，通過調控Hedgehog信號通路抑制HSC活化[8]。脂肪MSC來源的外泌體能夠轉運miR-122抑制HSC的增殖及活化[9]。TGF-β1是促HSC活化及肝纖維化的關鍵細胞因子[10]。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HucMSC-ex攜載Let-7b分子，HucMSC-ex作用后LX-2細胞中Let-7b表達水平增加，TGF-βR1表達降低。為進一步證實Let-7b對TGF-βR1的調控作用，本實驗采用Let-7b模擬物分析兩者之間的關系，結果表明Let-7b能夠顯著抑制TGF-βR1表達。由此表明，HucMSC-ex可能通過轉移Let-7b抑制TGF-βR1表達，下調TGF-β信號通路，抑制HSC活化和膠原沉積，提示Let-7b可能成為肝纖維化治療的一個潛在靶點。

本研究證實HucMSC-ex對LX-2細胞活化及TGF-βR1表達具有抑制作用，其機制可能與調控LX-2細胞Let-7b表達有關。然而，HucMSC-ex在肝纖維化模型中是否能夠轉運Let-7b定位于HSC，調控TGF-βR1表達，抑制HSC活化及其膠原的合成仍需要進一步觀察；HucMSC-ex對TGF-βR1信號通路下游分子的作用仍需進一步證實；HucMSC-ex作為遺傳信息的載體，含有大量的mRNA、miRNA及蛋白，除了Let-7b外其他的功能分子也可能在HSC活化中發(fā)揮作用，有待后續(xù)進一步尋找。