小麥花語苗染色體加倍技術(shù)研究

楊麗萍 朱晉云 李楠

自從20世紀70年代利用花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得大量花粉單倍體以來，花培技術(shù)的應(yīng)用潛力已日益顯示出來。花粉單倍體加倍后的二倍體(DH)在植物育種、突變、玻璃質(zhì)選擇、分子制圖和植物改良方面具有廣闊的應(yīng)用前景?；ㄅ嘤N的目的就是要獲得加倍的雙倍體植株以及選育出綜合性狀穩(wěn)定的優(yōu)良品種(系)。目前報道的小麥花粉加倍方法均是采用在分蘗盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘗節(jié)的方法，也有在組織培養(yǎng)過程中接加入秋水仙素的方法。但是，由于秋水仙素對植株的毒害作用較大，植株死亡率較高，結(jié)果仍不夠理想。為此，研究人員對這兩種加倍方法進行了比較和改良。

1材料和方法

試驗于2005～2007年進行。供試小麥材料為晉麥47×975025、農(nóng)大5013×臨遠993兩個不同雜種基因型F¹代花藥。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6+2，4-D2mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖10％；分化培養(yǎng)基為N6+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖3％：壯苗培養(yǎng)基為MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+多效唑3mg/L+蔗糖3％。

取穗時間以花粉單核中、晚期為最佳時期(即幼穗頂部距旗葉基部5～10cm，幼穗未露出旗葉鞘，花藥長度在2～3mm)。取回的穗子用濕毛巾包裹，放入4℃的冰箱預(yù)處理2～3天。接種前，剪去旗葉(留葉鞘)，用75％的酒精消毒，并從葉鞘下端將幼穗取出，無菌接種。

試驗分3種處理：

(1)對愈傷組織的處理。秋水仙堿的濃度為：O(CK)、0.02‰、0.05‰、0.1‰、0.3‰。處理溫度分兩種：一是愈傷組織在4℃低溫下春化一個月后，轉(zhuǎn)入含有秋水仙堿的脫分化培養(yǎng)基中，在25℃常溫下培養(yǎng)20天后將綠芽(苗)轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中(T1)，二是將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有秋水仙堿的脫分化培養(yǎng)基中，在4℃低溫下培養(yǎng)30天左右，再在25％常溫下培養(yǎng)15天(T2)，然后經(jīng)1～2次壯苗后移栽溫室，統(tǒng)計結(jié)實株數(shù)，計算結(jié)實株率。

(2)對再生苗根系的處理。將再生植株經(jīng)過壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別用0.2％的秋水仙堿溶液浸根5小時(處理1)和10小時(處理2) (24～25℃)、0.05％的秋水仙堿溶液浸根5小時(處理3)和10小時(處理4)(24～25％)，處理后將苗移栽溫室。統(tǒng)計結(jié)實株數(shù)，并計算結(jié)實株率。

(3)對分蘗節(jié)的處理。在分蘗盛期，將花粉植株從土中挖出，洗凈根部的泥土，在24～25℃條件下，用0.04％的秋水仙堿加1％的二甲亞砜溶液浸泡分蘗節(jié)，分5小時和10小時兩個處理，處理后重新移栽土中，統(tǒng)計結(jié)實株數(shù)，并計算結(jié)實株率。

結(jié)實株率(％)=結(jié)實株數(shù)/移栽綠苗數(shù)×100％

2結(jié)果與分析

2.1秋水仙堿對愈傷組織分化和加倍率的影響

由表1看出，無論在T1和T2處理中，0.02‰和0.05‰秋水仙堿濃度處理的愈傷組織再生植株結(jié)實率都明顯高于對照和其它處理，最高結(jié)實率達61.5％。最低33.3％，T2處理與T1處理相比，T2處理的結(jié)實率又高于T1。但從綠苗分化率來看，0.02‰的綠苗分化率顯著高于0.05‰的綠苗分化率，0.02‰的綠苗分化率比0.05‰的綠苗分化率高53.2～43.2個百分點。0.1‰和0.3‰秋水仙堿濃度處理的愈傷組織在25℃常溫下培養(yǎng)10天后逐漸褐化，只有“晉麥47×975025”獲得結(jié)實綠苗1株。

2.2秋水仙堿溶液浸根的濃度與時間對移栽成活率和加倍率的影響

秋水仙堿溶液浸根的濃度與時間對愈傷組織再生植株移栽成活率和加倍率有顯著的影響。經(jīng)過0.2％、0.05％濃度秋水仙堿5小時的浸根處理，“晉麥47×975025”花藥愈傷組織再生壯苗移栽成活率分別為69.6％和86.7％，高于10小時的浸根處理38.9個百分點和49.9個百分點：“農(nóng)大5013×臨遠993”花藥愈傷組織再生壯苗移栽成活

率分別為66.7％和76.5％，高于10小時的浸根處理39.4個百分點和53.4個百分點。說明無論高濃度還是低濃度長時間用秋水仙堿溶液浸根對再生苗都有一定的危害，高濃度的危害程度更大。

用0.2％的秋水仙堿浸根處理5小時，2個雜種基因型結(jié)實株率平均高這37.5％，顯著高于其它處理，說明用0.2％的秋水仙堿浸根處理5小時，是提高單倍體植株加倍率較為理想、有效的措施。

2.3秋水仙堿溶液浸泡分蘗節(jié)對加倍率的影響

從表3可以看出，無論用0.04％的秋水仙堿加1％的二甲亞砜溶液浸泡分蘗節(jié)5小時，還是10小時，其2個雜種基因型結(jié)實株率都高于用0.2％的秋水仙堿浸根處理5小時，0.04％的秋水仙堿加1％的二甲亞砜溶液浸泡分蘗節(jié)10小時，花粉植株加倍率可達50％以上，加倍效果比較穩(wěn)定。但是，經(jīng)過10小時處理的麥苗比經(jīng)過5小時處理的麥苗緩苗時間延遲，植株發(fā)育不好。雖然5小時處理比10小時處理的結(jié)實株率低8.3％～8.4％，但5小時處理的麥苗緩苗時間短，植株的發(fā)育較好。因此，用0.04％的秋水仙堿加1％的二甲亞砜溶液浸泡分蘗節(jié)的時間應(yīng)在5～10小時之間較為適宜。

3討論

早在1979年，Wenzel等就根據(jù)當(dāng)時科技發(fā)展情況提出了綜合運用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)、染色體加倍技術(shù)、細胞融合技術(shù)的“分解一綜合育種”方案，而其中倍性操作是該方案的重要環(huán)節(jié)。到目前為止秋水仙素是誘導(dǎo)植物體細胞染色體加倍的最有效的化學(xué)誘變劑，通過該法誘導(dǎo)培育出的良種已在生產(chǎn)中使用。

在花藥培養(yǎng)時利用秋水仙堿處理可增加雙單倍體的數(shù)量。這在多種植物中得到證實，在小麥花藥培養(yǎng)中也有許多報道。韓彬、陳孝等對硬粒小麥一簇毛麥的愈傷組織進行秋水仙堿處理，得到15.8％的結(jié)實率。王敬東，任賢等用0.2％的秋水仙堿浸根5小時，成活率為90.7％～100％，平均為94.2％；結(jié)實率的變化為7.7％～75.0％，平均為45.9％。鮑文奎等在小麥一黑麥雜種F1幼苗分蘗盛期用秋水仙堿溶液浸泡分蘗節(jié)，染色體加倍成功率為40.8％。

該試驗證明，在小麥花藥組織培養(yǎng)中，用0.02‰和0.05‰的秋水仙堿對愈傷組織(在時宜的條件下)進行染色體加倍處理可獲得33.3％～61.5％結(jié)實株率，比用0.2‰秋水仙堿浸根法(15.4％～37.5％結(jié)實株率)更經(jīng)濟、簡便，可達到快繁與加倍同時進行的目的。用0.04％的秋水仙堿加1％的二甲亞砜溶液浸泡分蘗節(jié)雖然能獲得38.3％～58.3％的結(jié)實株率，加倍效果也比較穩(wěn)定，但是，該方法需藥劑量大，成本較高，而且移栽后，幼苗成活率會受到影響。

針對不同材料的差異性，秋水仙素作用的濃度、時間、溫度、處理方法和材料部位等存在不同，有必要對秋水仙素誘導(dǎo)的關(guān)鍵技術(shù)因子進行研究。同時要對影響誘變效率的其它次要因素進行摸索，如預(yù)處理酸堿度，后處理手段等，這些方面人們往往忽視。所做工作和研究不多，有待加強。

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