2-甲氧基雌二醇對(duì)全腦缺血大鼠HIF-1α及RTP801的作用研究

彭靜華 張鴻日 黃麗娜 李云

[摘要] 目的 探討2-甲氧基雌二醇（2ME2）對(duì)全腦缺血大鼠HIF-1α及凋亡相關(guān)基因RTP801的作用。 方法 將成年雄性SD大鼠104只隨機(jī)分為對(duì)照組（n=8）、全腦缺血組（n=48）和全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組（n=48），后兩組按再灌注時(shí)間不同各分為6個(gè)亞組。采用改良的Pulsineli 4-VO方法行全腦缺血大鼠模型制作。Nissl染色進(jìn)行海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)，免疫組化及RT-PCR技術(shù)進(jìn)行HIF-1α及RTP801 mRNA表達(dá)檢測(cè)。 結(jié)果 全腦缺血2ME2干預(yù)組與全腦缺血組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)亞組相比，神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，HIF-1α表達(dá)減少，RTP801 mRNA表達(dá)減低（P＜0.05）。 結(jié)論 在全腦缺血急性期，2ME2抑制HIF-1α及凋亡相關(guān)基因RTP801表達(dá)，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] RTP801；全腦缺血；缺氧誘導(dǎo)因子-1；2-甲氧基雌二醇

[中圖分類號(hào)] R743.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）01-006-03

Effects of 2ME2 on hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis-related gene RTP801 in hippocampus following the global cerebral ischemia in rats

PENGJinghua1 ZHANGHongri2 HUANGLina1 LI Yun3

1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital to Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;2.Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital to Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 3.Department of Emergency, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2ME2 on the hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis-related gene RTP801 in hippocampus following the global cerebral ischemia in rats. Methods One hundred and four adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: sham group (n=8), global cerebral ischemia group (n=48) and global cerebral ischemia + 2ME2 treatment group (n=48), and the rats of GI group and GI + 2ME2 group were sacrificed after perfusion. The 4 vessel occlusion (4-VO)global ischemia rat model was produced. Nissl staining was used to perform quantitative analysis of cell numbers. Immunohistochemistry staining and RT-PCR provided the information of the distribution of positive cells to HIF-1α protein and the expression of RTP801 mRNA. Results The number of cells from GI + 2ME2 group was significantly higher than that from GI group (P＜0.05). 2ME2 significantly suppressed the levels of HIF-1α (P＜0.05). The expression of apoptosis-related gene RTP801 decreased significantly(P＜0.05). Conclusion 2ME2 has brain protective effect on global cerebral ischemia in rats. 2ME2 inhibits the elevation of hypoxia-inducible factor 1α, which inhibits the elevation of apoptosis-related gene RTP801.

[Key words] RTP801; Global cerebral ischemia; Hypoxia-inducible factor 1; 2-methoxyestradiol

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是能在低氧狀態(tài)下被激活的核轉(zhuǎn)錄因子，國(guó)內(nèi)外已有許多的研究表明在輕度腦缺血時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1表達(dá)增加具有保護(hù)作用，但是，有研究表明，在嚴(yán)重缺血缺氧時(shí)，大量HIF-1的表達(dá)表現(xiàn)為損傷性作用[1，2]。全腦缺血可發(fā)生于心跳驟停、休克、顱腦外傷、外科手術(shù)中的低壓等情況。目前，在全腦缺血缺氧過程中，關(guān)于缺氧誘導(dǎo)因子-1在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中的作用及機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HIF-1的抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）作用于全腦缺血大鼠模型，探討2ME2對(duì)全腦缺血大鼠HIF-1α及凋亡相關(guān)基因RTP801的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠104只，體重（320±21）g（購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、全腦缺血組（GI）及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組（GI+2ME2）3組，其中全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組按再灌注時(shí)間的不同，分為6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d 6個(gè)亞組，假手術(shù)組和各亞組均為8只大鼠。

1.2 模型制作及組織獲取

全腦缺血大鼠模型制作采用改良的Pulsineli 4血管閉塞法[3]。應(yīng)用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，手術(shù)電凝大鼠椎動(dòng)脈，24 h后同樣方法麻醉，將大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)夾閉10 min，同時(shí)將大鼠腦缺血前后以及取下夾閉頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾后的腦電圖作記錄。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同時(shí)間點(diǎn)將大鼠經(jīng)心灌注固定，取腦組織，行Nissl染色及免疫組化染色。用于行RT-PCR檢測(cè)的大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，分離出雙側(cè)海馬，放置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.3 2-甲氧基雌二醇干預(yù)

全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組中大鼠，2-甲氧基雌二醇腹腔注射應(yīng)用于松開雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾后（用量16 mg/kg），6 h、12 h及24 h亞組大鼠應(yīng)用2-甲氧基雌二醇1次，48 h組在第2天應(yīng)用1次同樣劑量，72 h、7 d組在第3天和第7天分別各應(yīng)用1次同樣劑量。GI組應(yīng)用等量生理鹽水腹腔注射，假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。2-甲氧基雌二醇購(gòu)于Sigma公司。

1.4 Nissl染色

將冰凍切片室溫放置30 min，放入4 ℃丙酮固定10 min；置于50～60 ℃溫箱內(nèi)、1%甲苯胺藍(lán)水溶液中40 min；蒸餾水洗滌；95%乙醇分化；脫水及透明后封片。

1.5 HIF-1α蛋白表達(dá)的檢測(cè)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)，DAB顯色，具體操作步驟按照試劑說明。HIF-1α多克隆一抗由武漢博士德公司提供。應(yīng)用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.6 RTP801 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)。Trizol提取RNA、反轉(zhuǎn)錄及PCR的實(shí)際步驟依照試劑盒說明。RTP801引物及β-actin由Invitrogen公司（美國(guó)）提供，cDNA合成試劑盒、Trizol試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒均由生工生物工程（上海）有限公司供應(yīng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在高倍鏡下，于每張切片海馬的CA1區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行神經(jīng)元密度（神經(jīng)元數(shù)/高倍鏡視野）及HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)以（χ±s）的形式表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組中各亞組與假手術(shù)組間比較采用方差分析，全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預(yù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全腦缺血大鼠模型制作

在夾閉大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈后2～3 min內(nèi)，腦電圖顯示為一直線表明模型制作成功。夾閉大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，將雙側(cè)動(dòng)脈夾同時(shí)取下，可見大鼠腦電波有部分程度的恢復(fù)，但腦電圖的頻率以及波幅均低于頸總動(dòng)脈夾閉之前。

2.2 Nissl染色以及神經(jīng)元計(jì)數(shù)

假手術(shù)組中大鼠海馬的CA1區(qū)為3～5層，神經(jīng)元形態(tài)清晰、數(shù)目多，染色比較均勻。GI組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)減少，并且可見神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變形、溶解并形成空泡。GI+2ME2組48 h、72 h、7 d亞組與GI組相應(yīng)亞組對(duì)比海馬CA1區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為4.59、4.58、8.86，P＜0.05），同時(shí)細(xì)胞損傷減輕，形態(tài)較規(guī)則，邊緣較清晰，軸突形態(tài)較好。染色神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)見表1（個(gè)/高倍視野，×400）。

2.3 HIF-1α蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)

鏡下以棕黃色細(xì)顆粒為HIF-1α蛋白陽(yáng)性信號(hào)。在假手術(shù)組中蛋白陽(yáng)性信號(hào)極其少見。而GI組的蛋白陽(yáng)性信號(hào)于缺血后6 h逐漸增加，在缺血后72 h達(dá)最高水平，7 d后基本到達(dá)正常。GI+2ME2組48 h、72 h、7 d亞組大鼠海馬CA1區(qū)HIF-1α較GI組相應(yīng)亞組蛋白陽(yáng)性信號(hào)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為5.14、6.07、10.40，P＜0.05）。陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)見表2（個(gè)/高倍視野，×400）。

2.4 RTP801 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

RTP801 mRNA在假手術(shù)組大鼠中未見表達(dá)，而缺血6 h后可見GI組大鼠RTP801 mRNA表達(dá)增加，先隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，24h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，7d后下降至正常水平。GI+2ME2組12 h、24 h、48 h、72 h亞組較GI組相應(yīng)亞組RTP801 mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為4.59、7.07、4.79、4.71，P＜0.05）。RTP801吸光度比值見表3。

3 討論

2-甲氧基雌二醇是雌激素的正常代謝產(chǎn)物，存在于人體的血液與尿液中，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HIF-1α[4]。HIF-1是由α、β兩個(gè)亞基形成的異二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，能夠被低氧狀態(tài)所激活[5]。HIF-1α屬于氧敏感亞基，HIF-1穩(wěn)定性主要由α亞基控制，HIF-1β在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。HIF-1參與調(diào)控下游一系列靶基因表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)由HIF-1直接啟動(dòng)的基因有60余個(gè)，其中包括一些HIF-1依賴的凋亡相關(guān)基因[1，2，5，6]以及對(duì)缺氧適應(yīng)性的基因，在腦缺血過程中HIF-1α相關(guān)促凋亡基因主要有p53、bcl-2家族某些成員（如其中bcl-Xs、bax等）、caspase（caspase 3、caspase 8、caspase 9）、RTP801、HGTD-P等。此類基因的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2ME2可抑制HIF-1α的過度表達(dá)，從而抑制靶基因的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。Helton R等[7]研究發(fā)現(xiàn)，將HIF-1α基因敲除后，HIF-1α在腦缺血缺氧小鼠中表達(dá)缺失，凋亡相關(guān)的基因表達(dá)減少，表明HIF-1α表達(dá)缺失在腦缺血的過程中具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，從而推測(cè)HIF-1α過度表達(dá)在腦缺血缺氧中是有害的。

RTP801是HIF-1α依賴的凋亡相關(guān)基因。RTP801是Shoshani T等[8]首次發(fā)現(xiàn)的，在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ图凹?xì)胞培養(yǎng)中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯上調(diào)，在大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型缺血半暗帶以及壞死區(qū)應(yīng)用原位雜交技術(shù)均檢測(cè)到RTP801，腦缺血缺氧過程中RTP801表達(dá)升高見于0.5～2.0 h內(nèi)，持續(xù)至少3 d，RTP801對(duì)缺氧反應(yīng)動(dòng)態(tài)的變化與已知的其他如VEGF等HIF-1靶基因類似，這提示了RTP801可能也是HIF-1依賴基因之一。實(shí)驗(yàn)顯示，正常ES細(xì)胞中，在缺氧條件下RTP801 mRNA的表達(dá)可被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而在HIF-1α-/- ES細(xì)胞內(nèi)同樣缺氧條件下卻沒有檢測(cè)到其表達(dá)，因此推測(cè)，HIF-1α調(diào)控缺氧條件下RTP801表達(dá)。RTP801表達(dá)作用可表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡或抗凋亡兩方面。應(yīng)用質(zhì)粒將RTP801 cDNA轉(zhuǎn)移至小鼠肺細(xì)胞中，這可導(dǎo)致大量細(xì)胞的死亡。在MCF7和PC12細(xì)胞中導(dǎo)入四環(huán)素選擇的啟動(dòng)子后可促進(jìn)RTP801的表達(dá)，葡萄糖缺乏的培養(yǎng)基中、低氧條件下以及H2O2誘導(dǎo)凋亡中可見細(xì)胞被保護(hù)，但是，在不再分裂的PC12細(xì)胞中，RTP801的表達(dá)增加具有細(xì)胞毒性，其可增加細(xì)胞對(duì)缺氧和氧化的敏感性。因此，RTP801過度表達(dá)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)取決于多種因素，包括細(xì)胞類型和狀態(tài)，不同狀態(tài)下在不同類型的細(xì)胞中，RTP801具有損傷或保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血缺氧6 h組大鼠可見RTP801表達(dá)，表達(dá)至高峰見于24 h組大鼠，此后表達(dá)逐漸減少，7 d組表達(dá)降至正常水平，可見RTP801 mRNA表達(dá)于全腦腦缺血缺氧急性期。2-甲氧基雌二醇治療組中可見神經(jīng)元計(jì)數(shù)增加，HIF-1α蛋白減少，RTP801表達(dá)減少，從而證明了RTP801是HIF-1依賴的，這個(gè)結(jié)果與Shoshani T等[8]結(jié)果也是一致的。因此，我們推測(cè)：在全腦缺血急性期，2ME2抑制HIF-1α及凋亡相關(guān)基因RTP801的表達(dá)，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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（收稿日期：2011-09-19）