細(xì)胞蛋白依賴性激酶10與病理性瘢痕

楊琳

1970年，Paul Nurse等以裂殖酵母為實驗材料，發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因，如：裂殖酵母cdc2等。CDC2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK），因此CDC2又被稱為CDK1，激活的CDK1可將靶蛋白磷酸化而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)，如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失，將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等，這些效應(yīng)的最終結(jié)果是細(xì)胞周期的不斷運行。因此，CDK激酶和其調(diào)節(jié)因子又被稱作細(xì)胞周期引擎。目前發(fā)現(xiàn)的CDK在動物中有13種，各種CDK分子均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，并根據(jù)這一保守域的序列而命名，其與細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合有關(guān)[1]。1994年，Grana和Brambilla 等[2-3]分別用兩種不同的PCR方法發(fā)現(xiàn)了CDK10，但到目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞周期蛋白與其結(jié)合。隨后，Li等[4]做了顯負(fù)性突變體（Dominant negative mutant）和抗敏菌的實驗，結(jié)果表明CDK10在細(xì)胞周期的G2/M期起到重要作用。人類CDK10的三種基因形式（hcdk10-1：X78342， hcdk10-2： L33264， hcdk10-3：AF153430）在2000年才被正式確定[5]。hcdk10-1與轉(zhuǎn)錄因子Ets2結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性[6]，hcdk10-2與細(xì)胞周期G2-M期有關(guān)[7]，目前為止，hcdk10-3的功能尚認(rèn)識不足。

1 細(xì)胞蛋白依賴性激酶10（CDK10）的分子結(jié)構(gòu)

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CDC2激酶廣泛存在于從酵母到人的多種生物中，形成了一個龐大的家族。不同生物種族，其結(jié)構(gòu)雖有差異，但具有很高的同源性[4]。典型的CDK 包含300 個氨基酸構(gòu)成的催化亞基，處于磷酸化狀態(tài)時其激酶活性能夠被激活[8]。目前已發(fā)現(xiàn)CDKs家族有13個成員，均屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其DNA序列同源性超過40%，其蛋白產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為30～40Ku，有一個催化核心，其磷酸化及去磷酸化決定了細(xì)胞周期的運行。Cdk10在基因圖譜上位于16q249。蛋白質(zhì)功能由其相應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)決定10，如果缺少了三維結(jié)構(gòu)，那么對研究蛋白質(zhì)的功能、代謝等都帶來很大的阻礙。2005年，人們發(fā)現(xiàn)CDK10 的三維結(jié)構(gòu)中有10個α螺旋和8個β折疊。此外，CDK10的三維結(jié)構(gòu)具有激酶家族的典型結(jié)構(gòu)特征：N端包含β折疊區(qū)域與C端的更大α螺旋區(qū)域形成一個二裂片基序。CDK10的N端還包括了PISSLRE螺旋，這段序列對應(yīng)于CDK2中的PSTALRE螺旋。發(fā)現(xiàn)CDK10構(gòu)象中變化最多的是T-loop區(qū)。T-loop區(qū)是CDK家族蛋白里變化最多的區(qū)域，這個區(qū)域可能是尋找藥物設(shè)計的一個適合區(qū)域。在于底物ATP的對接研究中發(fā)現(xiàn)Asp94，Lys39，Tyr21，Thr20這四個氨基酸殘基是CDK10活性位點中比較重要的殘基[11]。

2CDK10的活性調(diào)節(jié)

在M期，CDC25活性下降可使CDK10去磷酸化，去除了CDK10活化的障礙。而激活的M-CDK10還可以抑制它的抑制因子Wee1蛋白的活性，形成一個反饋環(huán)。因此，不難想象只要有少量的CDK25被激活，立即就會有大量的CDK10被活化。另外，CDK10的激活還需要Thr161的磷酸化，它必須在CDK激酶的作用下完成的[9]。CDK10沉默增加Ets2與c-RAF啟動子結(jié)合位點的結(jié)合，使c-RAF活性增強，進而激活使其下游MAPK途徑，包括MEK1，2和p42/p44 MAPK，而這又促進了cyclin D1的表達(dá)[12]。

3CDK10與細(xì)胞周期

細(xì)胞周期也稱細(xì)胞分裂周期，是指一個細(xì)胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個所經(jīng)歷的全過程，包括5個時相：G0期、G1期、S期、G2期和M期。無論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞的增殖都要經(jīng)過這5個階段。調(diào)控細(xì)胞周期中的許多生化事件是按一定順序，有條不紊地進行著。細(xì)胞周期依賴性激酶家族是一組功能各異、相互聯(lián)系、相互制約的核蛋白，控制細(xì)胞的增生反應(yīng)，近年來已被廣泛的研究[13-14]，細(xì)胞周期的進程被細(xì)胞周期依賴性激酶嚴(yán)格控制[15]。Hartwell還通過研究酵母菌細(xì)胞對放射線的感受性，提出了checkpoint（細(xì)胞周期檢驗點）的概念，意指當(dāng)DNA受到損傷時，細(xì)胞周期會停下來。Cdk10的反義和顯性負(fù)性突變體結(jié)構(gòu)都阻止細(xì)胞周期G2～M的進程，表明cdk10參與細(xì)胞增殖的必要性[7]。

4CDK10與 Ets2 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子Ets2 是ETS 家族中的一員，在細(xì)胞增殖、分化和發(fā)展中是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[16]。Est2轉(zhuǎn)錄因子包含保守點結(jié)構(gòu)域（conserved pointed domain）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transactivation domain），Kasten和Giordano的研究結(jié)果則揭示CDK10和轉(zhuǎn)錄因子Est2的N端相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄因子 Ets2 的轉(zhuǎn)錄活性[6]。

5CDK10與腫瘤

Charles等[17]認(rèn)為 CDKs 是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控因子。CDK10已經(jīng)被證實是非小細(xì)胞肺癌內(nèi)19個新基因中的一個[18-19]，Cdk10與肝癌、膽管癌、前列腺癌、乳腺癌也有關(guān)[20]。在用三苯氧胺輔助治療的乳腺癌患者中，CDK10低表達(dá)的患者復(fù)發(fā)的時間短并且整體存活率較差[14]。Lorn等[21-22]發(fā)現(xiàn) CDK10 表達(dá)缺失可促進三苯氧胺耐藥。在 RAF1 基因作用下，CDK10的表達(dá)缺失可增加轉(zhuǎn)錄因子ETS2 的活性，提 高 ERK /MAPK激酶通路活性并可減緩三苯氧胺耐藥的產(chǎn)生。此外，CDK10在主動脈-冠狀動脈旁路移植的疾病及濾泡性淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)[23-24]。

6CDK10與病理性瘢痕的關(guān)系

病理性瘢痕（pathological scar）是人類真皮內(nèi)特有的纖維代謝性疾病，以過量的纖維化和膠原蛋白的沉積為特征，是傷口愈合后局部纖維組織增生所致的病理狀態(tài)[25]，與創(chuàng)傷愈合過程中膠原、 纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積有關(guān)，是創(chuàng)傷過度愈合的結(jié)果[26]，而過度沉積的ECM主要是由其中的成纖維細(xì)胞合成或分泌。透射電鏡發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的密度和活性均增高，可見成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合瘢痕形成、增生和攣縮的功能性細(xì)胞，其增殖、活化分化的異常直接導(dǎo)致病理性瘢痕的形成[27]。劉永波等[28]的實驗表明，p53基因突變可以使細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，從而導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。TGF-β目前被認(rèn)為是與瘢痕過度形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，而阻斷TGF-β信號通路[29-30]，有望成為防治瘢痕疙瘩的途徑[31]。研究表明Ets2調(diào)節(jié)Cdc2的表達(dá)并對細(xì)胞周期有調(diào)控作用[32]。而Cdc2在哺乳細(xì)胞G2-M期起至關(guān)重要的作用，由于CDK10和轉(zhuǎn)錄因子Est2的N端相結(jié)合，因此，在病理性瘢痕中，其可能機制是CDK10低表達(dá)增加Ets2的轉(zhuǎn)錄活性，使Cdc2的水平升高，促進細(xì)胞周期進程，增加成纖維細(xì)胞數(shù)量，促進瘢痕的形成。Bowers[33]研究表明，瘢痕疙瘩的形成與內(nèi)分泌的改變有一定關(guān)系。瘢痕患者在妊娠期瘢痕疙瘩出現(xiàn)明顯的癥狀加重和體積增大，絕經(jīng)期后瘢痕疙瘩逐漸消退萎縮。通過測定發(fā)現(xiàn)瘢痕組織中雄激素水平升高， 他認(rèn)為，局部高水平的雄激素代謝，在瘢痕疙瘩形成中起著主要的或至少是輔助性的作用。劉嘉鋒等[34]對瘢痕以及正常皮膚組織中cyclinD1 、雄激素受體的表達(dá)進行了研究，發(fā)現(xiàn)瘢痕組織成纖維細(xì)胞中cyclin D1 和雄激素受體表達(dá)降低，且cyclin D1 和雄激素的表達(dá)顯示出一定相關(guān)性，表明雄激素受體與瘢痕的發(fā)生有關(guān)，其可能機制是通過與其配體結(jié)合，進一步啟動 cyclinD1基因表達(dá)而發(fā)揮作用。前面講到CDK10沉默最終可增強 cyclinD1的表達(dá)，因此，CDK10低表達(dá)可促進成纖維細(xì)胞的過度增生，從而促進瘢痕形成。

臨床中，人們觀察到瘢痕組織的形成和機體免疫應(yīng)答過程非常相似，初次創(chuàng)傷后瘢痕組織體積較小，發(fā)生慢，類似于初次免疫應(yīng)答的潛伏期，但再次受到損傷后會使瘢痕組織形成速度加快，體積增大，形成瘢痕疙瘩，類似于第二次免疫刺激的再次免疫應(yīng)答過程。此外，通過對瘢痕組織中細(xì)胞和蛋白質(zhì)成分分析表明，瘢痕組織中出現(xiàn)數(shù)量可觀的特異性免疫細(xì)胞（如 T 淋巴細(xì)胞） 抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），而且瘢痕組織的嚴(yán)重程度與創(chuàng)傷部位的淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)[35]。吳勇等[36]體外培養(yǎng)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，同時，在培養(yǎng)細(xì)胞中加入白細(xì)胞介素-2，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察其對成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，IL-2 促進成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)，對成纖維細(xì)胞的生長增殖起正性調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)在瘢痕組織中，TGF-β基因表達(dá)水平上調(diào)[37-38]。CDK10是否與這些因素有聯(lián)系，有待今后進一步研究。

7小結(jié)

多數(shù)病理性瘢痕都有細(xì)胞周期調(diào)控機制的破壞導(dǎo)致細(xì)胞生長失控、凋亡異常的特征。CDK10作為CDKs家族新的成員，處于細(xì)胞周期調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，在細(xì)胞生長和分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。而目前對CDK10的生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機制認(rèn)識尚不足。CDK10調(diào)控機制研究可能為病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展的研究提供新的線索，也可能為其治療提供新的思路。

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[收稿日期]2012-05-15 [修回日期]2012-07-20

編輯/李陽利