點(diǎn)陣CO₂激光和Nd：YAG激光對(duì)自然老化小鼠真皮重塑的比較研究

李蕊聯(lián)等

[摘要]目的：比較點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）對(duì)老化昆明小鼠真皮重塑的作用，并探討二者嫩膚作用機(jī)制，為臨床選擇治療方法提供理論依據(jù)。方法：應(yīng)用兩種波長(zhǎng)激光照射自然老化昆明小鼠背部脫毛皮膚，通過(guò)HE染色進(jìn)行成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度測(cè)量，飽和苦味酸-天狼猩紅染色觀察皮膚Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)及Gomori醛品紅染色觀察彈力纖維的變化。結(jié)果：兩組照射組中真皮厚度、成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)和彈力纖維容積分?jǐn)?shù)的值均高于正常對(duì)照組（P均<0.05）；點(diǎn)陣CO2激光組均高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）組（P均<0.05）；兩組照射組中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)均高于正常對(duì)照組（P均<0.05），但照射兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）均可引發(fā)小鼠真皮重塑，前者效果優(yōu)于后者。

[關(guān)鍵詞]點(diǎn)陣CO2激光；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）；自然老化小鼠；真皮重塑

[中圖分類號(hào)]R616.4R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

激光醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于皮膚科的臨床實(shí)踐中。近幾年，非剝脫性激光以及點(diǎn)陣激光的發(fā)展更為迅速，已經(jīng)占有了一席之地[1-2]。雖然有關(guān)兩者作用機(jī)制的研究也有報(bào)道[3-4]，但是二者針對(duì)皮膚組織結(jié)構(gòu)作用機(jī)制的比較研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)二者作用的靶組織或細(xì)胞變化的深入比較研究，可以進(jìn)一步揭開(kāi)二者作用差異的面紗，為臨床制定具體治療方法提供理論依據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在分析點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）對(duì)昆明小鼠真皮的影響并進(jìn)行對(duì)比研究，以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制的差異。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性自然老化昆明小白鼠24只，體重（45±7）g，鼠齡11～12個(gè)月，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2儀器設(shè)備：點(diǎn)陣CO2激光治療儀（上?？祳W），Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）（韓國(guó)Lutronic S6）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica）；偏振光顯微鏡（奧林巴斯）；光學(xué)顯微鏡及醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔麻醉。小鼠背部皮膚脫毛后，以脊柱為縱線和垂直于脊柱縱線的二分之一處為橫線將背部皮膚分為四個(gè)區(qū)。左側(cè)為對(duì)照區(qū)，不做任何處理；右側(cè)頭部區(qū)為點(diǎn)陣CO2激光照射區(qū)（簡(jiǎn)稱點(diǎn)陣區(qū)），尾部區(qū)為Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)（簡(jiǎn)稱長(zhǎng)脈寬區(qū)）。照射區(qū)皮膚用1‰新潔爾滅常規(guī)消毒后自然干燥。點(diǎn)陣CO2激光照射的能量為50mJ/cm2，正方形光斑（4mm×4mm），脈寬2ms，密度100/cm2，光斑之間不重疊照射一遍；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射的能量為14.1mJ/cm2，圓形光斑（3.0mm），脈寬0.3ms，光斑重疊1/3，照射兩遍；兩組照射面積均約2cm×2cm。24只小鼠激光照射4次，每次間隔10天，全部照射結(jié)束后，分別在第2周、1個(gè)月、3個(gè)月各處死8只小鼠，分別取每只小鼠四個(gè)部位的皮膚用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 組織學(xué)觀察：每只小鼠的四塊樣本，以10%甲醛溶液固定，乙醇梯次濃度逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片。常規(guī)HE切片用于計(jì)算成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)量真皮厚度；飽和苦味酸-天狼猩紅染色切片用偏振光顯微鏡照相以分析Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維含量；Gomori醛品紅染色切片用于分析彈力纖維含量。以上所有切片標(biāo)本均以每張切片隨機(jī)選取三個(gè)視野，用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析，最后取均值作為該切片的分值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)表格均由Microsoft Excel 2007繪制。計(jì)量資料采用x±s進(jìn)行描述，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后， Wilcoxon秩檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)用于兩組間的比較，方差分析比較各時(shí)間段之間的差別，兩兩比較采用LSD法，規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

肉眼觀察可見(jiàn)點(diǎn)陣CO2激光照射自然老化昆明小白鼠后，照射區(qū)域皮膚表面即刻呈現(xiàn)均勻的黃褐色點(diǎn)狀結(jié)痂，輕度水腫，次日水腫消失，點(diǎn)狀結(jié)痂3～7日脫落。脫痂后皮膚表面光滑，無(wú)瘢痕及色素異常；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)域皮膚表面微紅，無(wú)結(jié)痂，次日皮膚基本恢復(fù)正常。

2.1 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)成纖維細(xì)胞數(shù)量及真皮厚度的影響：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，HE染色標(biāo)本顯示兩種激光照射區(qū)相對(duì)于對(duì)照區(qū)成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度均顯著增加，點(diǎn)陣CO2激光照射較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射效果明顯（見(jiàn)表1、表2、圖2）。在照射后一個(gè)月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)及真皮厚度差別顯著（見(jiàn)圖1）。

2.2 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)膠原增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后，經(jīng)偏振光鏡檢飽和苦味酸-天狼猩紅切片可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維呈紅黃色，較粗大，而Ⅲ型膠原纖維呈綠色細(xì)絲狀，交織于Ⅰ型膠原纖維間。在兩波長(zhǎng)激光分別照射后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，照射區(qū)與對(duì)照區(qū)相比，Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見(jiàn)表3、表4、圖4）。點(diǎn)陣CO2激光與Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射后一個(gè)月的Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差別不明顯（見(jiàn)圖3）。

2.3點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射對(duì)彈力纖維增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個(gè)月及3個(gè)月，Gomori醛品紅染色標(biāo)本顯示照射區(qū)彈力纖維染色深，呈較長(zhǎng)細(xì)絲狀，波浪狀交織于增生膠原纖維間（見(jiàn)圖5箭頭所示），而對(duì)照區(qū)真皮彈力纖維短、染色淺；在激光照射后一個(gè)月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)的彈力纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見(jiàn)表5、圖6）。

2.4 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射區(qū)在不同時(shí)間段的方差：分析比較：（見(jiàn)表6）。

3討論

2004年Manstein等[2]發(fā)表點(diǎn)陣式光熱作用（fractional photothermolysis， FP）理論，并迅速應(yīng)用于臨床，減少了治療風(fēng)險(xiǎn)，并顯現(xiàn)出良好的療效。點(diǎn)陣CO2激光照射的是小部分皮膚，為三維的熱治療區(qū)域（Microscopic treatment zones，MTZs），每個(gè)MTZ形成熱損傷區(qū)域（10～100μm），其外周為未損傷的正常組織。點(diǎn)狀的損傷可以通過(guò)周圍存在的未受損細(xì)胞遷移使表皮細(xì)胞迅速修復(fù)，從而使治療后皮膚能快速恢復(fù)，無(wú)需休假，避免了傳統(tǒng)剝脫性治療的風(fēng)險(xiǎn)[5]。Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）幾乎不損傷表皮細(xì)胞即可達(dá)到嫩膚的作用[6]。

皮膚老化常表現(xiàn)為皺紋、皮膚彈性下降、色素?fù)p害、毛細(xì)血管擴(kuò)張等。顯微鏡下組織學(xué)改變表現(xiàn)為膠原纖維、彈力纖維減少，真皮層變薄。真皮層的主要結(jié)構(gòu)為大量的成束的縱橫交錯(cuò)的膠原纖維和少量的彈性纖維組織。因此，所謂的真皮重塑主要表現(xiàn)或者指標(biāo)也就是Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成的重新啟動(dòng)。諸多的研究已證實(shí)激光照射后Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成大于降解[7，8]。點(diǎn)陣激光照射后Ⅲ型膠原纖維3天開(kāi)始合成[9]，7天可見(jiàn)Ⅲ型膠原纖維沉積[10]。點(diǎn)陣CO2激光治療面部萎縮性痤瘡瘢痕[11]及手背部皮膚[12]，發(fā)現(xiàn)1個(gè)月時(shí)痤瘡疤痕及皮膚光老化改善明顯，有新的膠原沉積。國(guó)內(nèi)羅瑤佳等[13]用超脈沖二氧化碳點(diǎn)陣激光治療皮膚痤瘡瘢痕，于1個(gè)月及3個(gè)月時(shí)觀察療效滿意。Chiba等[4]在用Nd：YAG激光進(jìn)行面部嫩膚治療后發(fā)現(xiàn)改善皺紋，皮膚質(zhì)地及松弛效果明顯，真皮乳頭層膠原纖維沉積明顯。以上報(bào)道基本與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[14]。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為自然老化小鼠，與人類的自然老化有相同之處，通過(guò)對(duì)其研究可以為人類臨床美膚提供科學(xué)理論依據(jù)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)2周時(shí)在照射區(qū)域出現(xiàn)Ⅰ型膠原纖維沉積，1月時(shí)達(dá)到最高值，3月時(shí)沉積較前減少，但仍高于對(duì)照區(qū)，這些結(jié)果有助于我們了解激光照射后刺激膠原纖維合成的時(shí)間；而Ⅲ型膠原纖維至3月時(shí)仍呈現(xiàn)明顯沉積趨勢(shì)，其合成大于降解[9]，可能與Ⅲ型膠原纖維在老化皮膚沉積較多有關(guān)[16]；同時(shí)，彈力纖維亦呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性沉積關(guān)系[17]；均表明其臨床治療間隔可以在三個(gè)月以后進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）照射均可明顯引發(fā)真皮重塑，前者較后者具有更好的照射效果，造成這種差異的可能原因在于點(diǎn)陣CO2激光的波長(zhǎng)（10600nm）高于Nd：YAG激光波長(zhǎng)（1 064nm）。相比而言，較長(zhǎng)的點(diǎn)陣CO2激光波長(zhǎng)穿透能力強(qiáng)，可達(dá)真皮的中層，能夠更好的將機(jī)械效應(yīng)及光熱效應(yīng)作用于真皮中上層的成纖維細(xì)胞及真皮血管，激活組織自我修復(fù)，其中成纖維細(xì)胞和真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子可能參與組織修復(fù)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，使膠原蛋白發(fā)生重組和增生；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）其作用機(jī)理可能是真皮及其血管受激光光熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)損傷，膠原蛋白熱變性，繼而激活組織修復(fù)過(guò)程，引發(fā)成纖維細(xì)胞增殖，引起膠原蛋白重組增生以達(dá)到真皮重塑的目的[6]。點(diǎn)陣CO2激光照射后的成纖維細(xì)胞數(shù)目及真皮厚度在1個(gè)月時(shí)較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)）照射效果明顯，但其長(zhǎng)期效果并不具有明顯優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明二者均能有效改善皮膚質(zhì)地、增加皮膚彈性，是進(jìn)行真皮重塑的很好的選擇。比較多位學(xué)者的治療結(jié)果，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)陣CO2激光效果雖好，但點(diǎn)陣CO2激光治療時(shí)患者的疼痛感高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1064nm波長(zhǎng)），且恢復(fù)期也較長(zhǎng)[4，11]。相對(duì)臨床而言，二者皆可作為治療皮膚光老化進(jìn)行真皮重塑的良好選擇[3，18]，Nd：YAG激光（準(zhǔn)長(zhǎng)脈寬1 064nm波長(zhǎng)）損傷小，停工期短，更適合現(xiàn)在的快節(jié)奏生活，但對(duì)于較重的老化皮膚或?qū)Ο熜в袕?qiáng)烈愿望，建議用點(diǎn)陣CO2激光。本實(shí)驗(yàn)未明確真皮發(fā)生變化的分子機(jī)理，有待于在今后的學(xué)習(xí)中進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2012-06-15[修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟