局部miR—126基因治療促進(jìn)小鼠缺血后肢血管新生的觀察

曾淑紅 易成剛 郭樹忠

[摘要]目的：通過(guò)體外構(gòu)建重組腺病毒miR-126，應(yīng)用于小鼠缺血后肢腓腸肌局部治療，觀察miR-126對(duì)缺血局部具有促血管新生作用。方法：重組腺病毒miR-126包裝 、純化、滴度的鑒定；C57小鼠隨機(jī)分為A組（C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）、B組（空病毒C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）、C組（重組腺病毒miR-126 C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）三組，制作小鼠缺血后肢模型，術(shù)后即刻將重組腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓腸肌。分別于3、7、14天各組（3只）取左后肢腓腸肌做HE染色、CD31免疫組化染色、western blot檢測(cè)Akt、ERK1/2、pAkt、pERK1/2蛋白水平以及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)等。結(jié)果：各種檢測(cè)結(jié)果顯示C組較A、B兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯，新生血管數(shù)目計(jì)數(shù)明顯增多，miR-126表達(dá)水平明顯增高，尤其在第7天升高最為明顯，以及VEGF、bFGF等介導(dǎo)的IP3和MAPK信號(hào)通路中ERK1、pERK1、AKT和 pAKT蛋白水平表達(dá)明顯增高。結(jié)論：miR-126局部應(yīng)用于缺血后肢，通過(guò)激活A(yù)kt、ERK1/2的相關(guān)通路，促進(jìn)血管新生，利于缺血后肢功能恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]miR-126；缺血后肢；血管新生；Akt；ERK1/2；

[中圖分類號(hào)]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

microRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性微小RNA，通過(guò)與靶mRNA的5'或3'端的非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合而使靶mRNA翻譯抑制或降解[1]。 miR-126位于染色體9q34.3的宿主基因Egfl7（上皮生長(zhǎng)因子-7）[2]，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生物功能的諸多方面，包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞骨架的形成、毛細(xì)血管網(wǎng)的穩(wěn)定以及細(xì)胞的存活等等，表明它是活體中維持功能性血管結(jié)構(gòu)的前提，對(duì)血管新生起著至關(guān)重要的作用，展示了良好的應(yīng)用前景[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外構(gòu)建重組腺病毒miR-126，局部應(yīng)用于小鼠缺血后肢，觀察其在局部表達(dá)情況的變化，以及促缺血局部血管新生的作用，從而及早、有效的促進(jìn)缺血后肢功能的恢復(fù)情況，探索miR-126基因治療在臨床上應(yīng)用的可行性。

1材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57小鼠，雌性，12周，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器：顯微外科手術(shù)器械、顯微外科顯微鏡、酶標(biāo)儀、電泳電源、電泳器材、轉(zhuǎn)膜電源、半干轉(zhuǎn)器材、滾筒架、發(fā)光儀、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP）、水平電泳槽、超凈工作臺(tái)、干燥消毒烤箱、紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)。

1.3 試劑：CD31抗體（Abcam）、二抗（Elvision法）、DAB顯色液、裂解液、ERK1/2抗體、、AKT抗體、pERK1/2抗體、pAKT抗體、轉(zhuǎn)膜液、發(fā)光液（Santa Cruz）、麗春紅染料、封閉液、NC膜、電泳液、SDS凝膠試劑、GADPH、RT-PCR引物合成 （ABI，北京）、RNasin （Promega，美國(guó)）、M-MLV （Promega，美國(guó)）、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）。

2方法

2.1 重組腺病毒miRNA-126包裝 、純化、滴度的鑒定：根據(jù)mus-mir-126 的基因信息， 設(shè)計(jì)上、下游引物如下：

以小鼠基因組DNA為模板擴(kuò)增mus-mir-126 基因；全基因合成mus-mir-126 基因至PES 載體上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5 CMV-IRES-GFP 載體上；質(zhì)粒擴(kuò)增、鑒定及線性化；重組腺病毒的包裝；用滴定法測(cè)定重組腺病毒滴度。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：C57小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只：A組、C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；B組、空病毒C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；C組、重組腺病毒miRNA-126 C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組。

2.3 C57小鼠左后肢缺血模型的構(gòu)建：在顯微外科鏡下，小鼠左側(cè)腹股溝處暴露股動(dòng)脈深、淺支，近、遠(yuǎn)端結(jié)扎，中間離斷，縫合傷口。

2.4 給藥方法：空病毒組、重組腺病毒miRNA-126組用1ml注射器對(duì)左后肢腓腸肌局部注射，滴度為1×109OPU/ml，各50μl，按組分籠喂養(yǎng)。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)：

2.5.1 大體觀察：各組0～14天末梢血運(yùn)狀況的觀察。

2.5.2 組織學(xué)檢測(cè)：7天、14天分別取左后肢腓腸肌組織，進(jìn)行HE 染色、血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31 染色，計(jì)算血管數(shù)目、密度。

2.5.2.1 石蠟切片常規(guī)HE染色。

2.5.2.2 CD31染色（Elivision法）：選取5μm厚的石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，壓力鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30min，10%山羊血清封閉液37℃溫育15min，PBS沖洗，滴加稀釋兔抗鼠CD31一抗（Abcam 1：250）4℃過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗37℃溫育30min，沖洗、滴加新鮮配制的DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，閱片。

2.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：各組C57小鼠第3、7、14天處死（各組每次3只小鼠），取左后肢腓腸肌組織做miR-126基因水平檢測(cè)。RNA的提?。粚?shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)上下游引物設(shè)計(jì)；取5ug RNA運(yùn)用Promega MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl；取0.5μl RT產(chǎn)物 運(yùn)用SYBR？ Premix Ex TaqTM （TaKaRa） 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)；數(shù)據(jù)處理。

2.5.4Western blotting 檢測(cè)分析：各組C57小鼠第14天處死，取左后肢腓腸肌組織ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平檢測(cè)。取出-80℃冰箱中的組織，解凍，稱取約20mg左右的小鼠腓腸肌組織加入裂解液，離心，提取蛋白；蛋白定量（BCA法）；采用SDS凝膠試劑盒配制12%的分離膠和3%的濃縮膠，上樣，跑電泳，90V，130V，90min；使用半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜，從下至上超厚濾紙、NC膜、膠、超厚濾紙的順序組裝，設(shè)置25V，30min；麗春紅染色，封閉，將NC膜放入稀釋液配制的一抗ERK1/2（1：1000）、、AKT（1：1000）、pERK1/2（1：1000）、pAKT（1：1000）的試管（50ml）中，試管固定于滾筒架上4℃過(guò)夜，洗膜，加二抗，山羊抗兔二抗（1：2000，用于ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT檢測(cè)），山羊抗小鼠二抗（1：2000，用于GAPDH檢測(cè)）室溫孵育1小時(shí)；配置發(fā)光液，在發(fā)光儀中發(fā)光，western分析軟件、統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用單因素方差分析。

3結(jié)果

3.1 重組腺病毒microRNA-126構(gòu)建、純化、滴度測(cè)定：見表1。重組腺病毒包裝、擴(kuò)增后，應(yīng)用滴定法測(cè)定病毒的滴度（TCID50）。

病毒TCID50 為：T=101+d（9.5-0.5）=101+1×（9.5-0.5）=1.00×1010TC ID50/ml，換算為病毒的PFU 滴度為：T=1010-0.7=109.3=2.00×109（PFU/ml），用時(shí)稀釋成1.00×109（PFU/ml）。

3.2大體觀察：各組0～14天從外形皮色、皮溫及肌肉萎縮狀況觀察，三組0～7天差別不很明顯。7～14天A、B組較C組相對(duì)皮色淤青明顯、肌肉有輕度萎縮、后肢中段周經(jīng)測(cè)量稍小，平均相差約0.5mm。

3.3組織學(xué)檢測(cè)

3.3.1 HE染色：第7天C組：低倍鏡下萎縮纖維中有再生肌纖維，無(wú)明顯新生血管；高倍鏡見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，有明顯的血管芽，個(gè)別有新生血管腔形成；A組：低倍鏡下肌萎縮明顯，高倍鏡見內(nèi)皮細(xì)胞扁平，呈梭形；B組：低倍鏡下肌萎縮明顯，炎癥明顯，高倍鏡見內(nèi)皮細(xì)胞扁平，呈梭形。圖1～3。

第14天C組低倍鏡血管肉芽組織增生，有大量新生血管增生，高倍鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、增生，有大量血管腔形成；A組低倍鏡有肌萎縮，未見明顯肉芽組織增生，高倍鏡有少量血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，少見新生血管形成；B組低倍鏡有肌萎縮，未見明顯肉芽組織增生，高倍鏡有少量血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，少見新生血管形成。圖4～6。

3.3.2 CD31免疫組化染色：第7天高倍鏡下C組較A、B組CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯，有血管芽形成，未見明顯新生血管腔。圖7～9。

第14天低倍鏡下C組較A、B組CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯，有大量血管芽形成及明顯多的新生血管腔形成。結(jié)果表明C組的標(biāo)記CD31陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞較A、B組明顯增多。圖10～12。

3.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-126的表達(dá)水平：①Cr：重組腺病毒miR-126 C57小鼠右側(cè)后肢組；②陰：正常C57小鼠左后肢組；③A：C57小鼠左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；④B：空病毒C57小鼠左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；⑤Cl：重組腺病毒miR-126 C57小鼠左側(cè)缺血后肢手術(shù)組。圖13。

設(shè)陰性組3天的miR-126的表達(dá)量設(shè)為1，各組數(shù)據(jù)為相對(duì)表達(dá)量，即平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析采用Student's t test。陰性組與Cr組在3day，7day，14day均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。陰性組與A、B、Cl組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組與B組在3天，7天，14天均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Cl組在3天，7天，14天與其他組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)果表明A組缺血組織中的miR-126水平在術(shù)后明顯降低，尤其第7天，降低最明顯，14天有回升，但未及正常水平。C組術(shù)后miR-126水平呈上升趨勢(shì)，尤其是第7天達(dá)最高水平，14天水平有回落，但仍高于正常水平。這與組織學(xué)檢測(cè)的結(jié)果正好相符。Cr組的miR-126水平與陰性組相一致，說(shuō)明體外重組腺病毒miR-126局部注射于小鼠缺血后肢，可以明顯增加缺血局部組織中miR-126水平的表達(dá)，而不影響其它部位miR-126的水平。

3.5 western blotting監(jiān)測(cè)分析：見圖14。各組數(shù)據(jù)為相對(duì)表達(dá)量，即平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析采用Student's t test（*P<0.05，**P<0.01）。

結(jié)果顯示C組較B組、A組中ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT的蛋白表達(dá)水平明顯增高。表明缺血組織局部被動(dòng)高表達(dá)miR-126，可以明顯的增加ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平的表達(dá)，說(shuō)明miR-126是激活了VEGF、FGF等生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的MAPK和PI3的信號(hào)通路。

4討論

組織移植是整形外科和燒傷外科等學(xué)科臨床上最常用的治療手段，移植組織術(shù)后存活的基本條件是在移植組織耐缺血時(shí)限之內(nèi)及時(shí)重建血液循環(huán)，血運(yùn)重建的時(shí)間和質(zhì)量與移植組織的存活及存活質(zhì)量有密切的關(guān)系。

臨床實(shí)踐中組織移植術(shù)后，移植的組織通過(guò)與受區(qū)重建血液循環(huán)而存活。通常較薄的組織（如皮片移植）和體積較小的組織（如少量的顆粒脂肪移植）比較容易建立血運(yùn)而易于存活，而較厚的組織（如真皮下血管網(wǎng)皮片移植）和體積較大的組織（如大量脂肪注射、大塊的組織工程組織移植），往往因?yàn)椴荒茉谀腿毖獣r(shí)間內(nèi)及時(shí)、有效的重建血液循環(huán)而不易存活，這也就是真皮下血管網(wǎng)皮片移植、大量脂肪移植等，目前在臨床廣泛應(yīng)用中面臨的巨大難題，因此移植術(shù)后能否及時(shí)、有效的重建血運(yùn)是提高移植組織存活率和存活質(zhì)量的關(guān)鍵。另外，冠心病、腦梗死、肢端缺血性壞死等缺血性病變?nèi)允桥R床上十分常見的疾病，這些缺血疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵也是及時(shí)、有效的重建血運(yùn)。重建血運(yùn)的重要途徑就是促進(jìn)缺血局部的血管新生，改善缺血局部血供，利于缺血局部功能恢復(fù)。

血管新生主要是由于機(jī)體受到各種病理或生理上的刺激，如組織再生、缺血、缺氧，炎癥，以及腫瘤生長(zhǎng)等因素，引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成熟等，從而形成新的血管。內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管系統(tǒng)的基本單位，也是新血管形成的前提、重要條件。

miR-126是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平，調(diào)節(jié)功能性血管形成的重要因素。Fish J.E等[3]、Wang S等[4]的研究表明在胚胎發(fā)育過(guò)程中敲除 miR-126基因，由于引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，出現(xiàn)血管滲漏、內(nèi)出血以及胚胎致死等。Coen van Solingen等[5]通過(guò)在活體外構(gòu)建miR-126拮抗劑，單次大劑量通過(guò)靜脈用于左后肢缺血鼠中，檢測(cè)血管數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，進(jìn)一步證實(shí)了miR-126拮抗劑對(duì)血管形成和動(dòng)脈生成有明顯的抑制作用。說(shuō)明miR-126正常水平的維持是功能性血管形成的前提及重要的條件。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血后肢中，miR-126的水平較正常后肢明顯降低，依此設(shè)想通過(guò)體外基因包裝技術(shù)被動(dòng)提供缺血局部miR-126的表達(dá)水平，就可以促進(jìn)缺血局部功能性血管新生，加快缺血局部功能的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)體外以小鼠基因組DNA 為模板擴(kuò)增mus-mir-126 基因，經(jīng)重組腺病毒包裝、純化、滴度檢測(cè)，局部注射于小鼠缺血后肢的腓腸肌，結(jié)果顯示缺血局部miR-126的表達(dá)水平明顯提高，說(shuō)明基因病毒包裝技術(shù)的成熟與有效，以及局部注射基因方法的可行性。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)缺血局部被動(dòng)高表達(dá)miR-126，不會(huì)對(duì)其他部位或組織中miR-126水平造成影響，從而確保了miR-126基因治療的安全性、高效性。

在本實(shí)驗(yàn)中缺血局部高表達(dá)miR-126，可以通過(guò)激活VEGF、bFGF介導(dǎo)的MAPK（ERK1/2）和PI3（AKT）的信號(hào)通路，明顯的促進(jìn)缺血局部的血管新生。AKT和ERK1/2是MAPK和PI3信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT表達(dá)水平的明顯升高，說(shuō)明MAPK和PI3信號(hào)通路的激活。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，spred-1[6]和PIK3R2（p85β）[7]是MAPK和PI3信號(hào)通路的抑制分子，同時(shí)也是miR-126的靶向mRNAs，miR-126在轉(zhuǎn)錄后水平，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs[3-4]。所以缺血局部高表達(dá)的miR-126，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs水平，解除其對(duì)MAPK和PI3信號(hào)通路的抑制，激活并促進(jìn)MAPK和PI3信號(hào)通路的傳導(dǎo)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移及成熟等，促進(jìn)缺血局部的血管新生，改善缺血局部的血供，利于缺血局部功能及早恢復(fù)。

miR-126還靶向抑制VCAM-1（血管細(xì)胞粘附分子1）mRNA[8]，VCAM-1是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞粘附分子，而miR-126可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞表面VCAM-1的表達(dá)，減少炎細(xì)胞（主要是白細(xì)胞）與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，減少局部炎癥作用的發(fā)生，降低并發(fā)癥，促進(jìn)血管新生的作用。

對(duì)于miR-126機(jī)制的研究不斷深入，Stefania nicoli等[9]（2010）在斑馬魚的胚胎發(fā)育過(guò)程中，觀察到血流對(duì)于主動(dòng)脈弓的血管形成非常重要，而且表明主動(dòng)脈弓的血管形成是通過(guò)血流刺激、誘導(dǎo)的基因通路形成的，這種基因通路是機(jī)械敏感性鋅指轉(zhuǎn)錄因子klf2a誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性microRNA-miR-126激活Vegf介導(dǎo)的信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)主動(dòng)脈弓的血管形成，且證明在斑馬魚胚胎的主動(dòng)脈弓血管形成的生理發(fā)育過(guò)程中，klf2a是miR-126的上游分子。

雖然目前對(duì)于miR-126的研究，在血管新生、腫瘤[10-12]等方面已有不少發(fā)現(xiàn)，但有關(guān)機(jī)制方面仍存在許多未知。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外構(gòu)建重組腺病毒miR-126，缺血局部注射基因，觀察到缺血局部miR-126的表達(dá)水平明顯提高，缺血局部血管新生作用明顯的增強(qiáng)，這使將來(lái)過(guò)渡到臨床應(yīng)用成為可能。

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[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟