多重?zé)晒釶CR鑒別診斷豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒

陳靜靜 羅寶正 沙才華(等)

摘要：為了建立一種快速、靈敏、特異的能夠同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒的多重?zé)晒猓校茫曳椒?，根?jù)ＧｅｎＢａｎｋ中公布的豬瘟病毒基因序列，設(shè)計(jì)一套特異性的引物和探針，對(duì)豬瘟病料提?。遥危?，經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增后將產(chǎn)物回收，克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ構(gòu)建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ陽(yáng)性質(zhì)粒；非洲豬瘟的目的片段序列采用化學(xué)合成，構(gòu)建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ陽(yáng)性質(zhì)粒。以兩種陽(yáng)性質(zhì)粒為模板對(duì)建立的多重?zé)晒猓校茫曳椒ㄗ鎏禺愋浴㈧`敏度和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法可以將豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒同口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒、豬圓環(huán)病毒２型區(qū)分開(kāi)，靈敏度可以達(dá)到１０拷貝的數(shù)量級(jí)，而且方法穩(wěn)定。對(duì)２份已知豬瘟陽(yáng)性血清樣品和１２０份豬內(nèi)臟、豬鼻腔拭子及血清樣品檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)已知陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果符合預(yù)期目標(biāo)，未知樣品檢出豬瘟病毒３份陽(yáng)性，未檢出非洲豬瘟病毒陽(yáng)性。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；非洲豬瘟病毒；多重?zé)晒猓校茫?；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：Ｓ８５５．３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：１００７－２７３Ｘ（２０12）02-0004-03

豬瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＣＳＦ）又稱豬霍亂（Ｈｏｇ cｈｏｌｅｒａ，ＨＣ），是由豬瘟病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引起的一種高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ＯＩＥ）將其列為必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病。１９世紀(jì)３０年代，該病在美國(guó)俄亥俄州首次報(bào)道，后來(lái)在亞洲、美洲、歐洲和非洲均有不同程度的流行。目前，雖然世界上有些國(guó)家宣布消滅了豬瘟，但是在亞洲、歐洲、非洲及南美洲的墨西哥、古巴等國(guó)家，豬瘟仍然存在［１，２］。由于該病暴發(fā)時(shí)會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且在國(guó)際貿(mào)易中宣布無(wú)豬瘟國(guó)家往往會(huì)出臺(tái)相關(guān)貿(mào)易政策限制豬瘟疫區(qū)國(guó)家豬肉和種豬的進(jìn)口，所以對(duì)于很多豬瘟疫區(qū)的國(guó)家而言，早期檢測(cè)豬瘟病毒對(duì)于豬瘟的防控和根除顯得尤為重要。

非洲豬瘟（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＡＳＦ）是由非洲豬瘟病毒（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）引起的一種豬的烈性、高度接觸性傳染病，在ＯＩＥ中也是被列為Ａ類動(dòng)物傳染病。雖然非洲豬瘟屬于非洲本土病，但是從１９２１年肯尼亞第一次報(bào)道后到目前已經(jīng)有４９個(gè)國(guó)家報(bào)道過(guò)非洲豬瘟疫情［３］，我國(guó)迄今雖然沒(méi)有非洲豬瘟的發(fā)病報(bào)道，但由于與非洲豬瘟疫區(qū)國(guó)家有相關(guān)貿(mào)易活動(dòng)所以存在該病潛入的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在２００８年發(fā)布的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中將豬瘟和非洲豬瘟都列入了一類動(dòng)物疫病。

豬瘟和非洲豬瘟是豬的兩種重要病毒病，雖然病原學(xué)分類不同，但是感染后臨床癥狀及病理變化差別很小，單純靠臨床診斷和剖檢變化不能區(qū)分兩種病，只能依據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷才能定性。目前針對(duì)于豬瘟和非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依據(jù)病原學(xué)、血清學(xué)及核酸檢測(cè)技術(shù)。病原學(xué)和血清學(xué)方法存在一定的局限性，近年來(lái)在ＰＣＲ基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的熒光ＰＣＲ技術(shù)以其直觀、快速、靈敏、特異及污染性小等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)方面。本研究擬建立可同時(shí)檢測(cè)豬瘟和非洲豬瘟的多重?zé)晒猓校茫曳椒?，以期能在豬瘟和非洲豬瘟的疫情監(jiān)測(cè)及綜合防控中發(fā)揮獨(dú)特作用。

１材料與方法

１．１材料

毒株：病毒均為疫苗毒。豬瘟疫苗，廣東永順生物制藥有限公司；口蹄疫疫苗，中牧集團(tuán)股份有限公司；豬傳染性胃腸炎疫苗，哈爾濱獸醫(yī)研究所；豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗，南京科農(nóng)生物技術(shù)研究所；豬水泡病病毒ＲＮＡ和豬圓環(huán)病毒２型重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑和儀器：ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取試劑盒，購(gòu)自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司；Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ試劑盒，ＤＮＡ膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋ，ｐＭＤ１８－Ｔ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，美國(guó)Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

１．２方法

１．２．１病毒ＲＮＡ提取采用ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取試劑盒，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別提取豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的ＲＮＡ，將提取的ＲＮＡ于－２０℃保存，備用。

１．２．２引物和探針的設(shè)計(jì)合成在ＧｅｎＢａｎｋ上下載多條豬瘟病毒的全基因組序列，利用ＤＮＡＳｔａｒ進(jìn)行序列比對(duì)后在保守區(qū)域５ＵＴＲ內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針。非洲豬瘟的引物和探針采用ＯＩＥ公布的參考序列，引物探針由上海超世生物科技公司合成。序列見(jiàn)表１。

１．２．３豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ使用引物對(duì)ＣＳＦＶ８１－Ｆ和ＣＳＦＶ８１－Ｒ以１．２．１中所提豬瘟病毒ＲＮＡ為模板進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增，獲取克隆用目的片段。使用ＴａＫａＲａ一步法試劑盒，體系如下：２×Ｂｕｆｆｅｒ １２．５ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｆ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １．０ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ ７．０ μＬ、ＲＮＡ ２．５ μＬ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ＜１．０ μｇ），共２５ μＬ。反應(yīng)程序：５０℃ ３０ ｍｉｎ，９５ ℃ ２ ｍｉｎ，９５ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ４０ ｓ，７２ ℃ ７ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后用２．０％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

１．２．４陽(yáng)性質(zhì)粒的制備將１．２．３中獲得的豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物目的片段膠回收，純化后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)ＪＭ１０９，對(duì)培養(yǎng)后的克隆菌提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送至廣州英駿公司測(cè)序，鑒定后即成功構(gòu)建可用作豬瘟陽(yáng)性對(duì)照的重組質(zhì)粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ。由于非洲豬瘟沒(méi)有病料，將目的片段序列由寶生物工程（大連）有限公司合成，然后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ構(gòu)建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ重組質(zhì)粒。

１．２．５引物、探針濃度的優(yōu)化使用ＴａＫａＲａ一步法試劑盒，體系為３５ μＬ，分別調(diào)整豬瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探針各１．０、１．２、１．５、１．８、２．０ μＬ與非洲豬瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探針各２．０、１．８、１．５、１．２、１．０ μＬ相混合，通過(guò)擴(kuò)增曲線的Ｃｔ值和熒光高度直觀看出最佳引物和探針濃度組合。

１．２．６特異性試驗(yàn)按照１．２．５中優(yōu)化的豬瘟和非洲豬瘟的最佳引物和探針濃度組合配制多個(gè)熒光ＰＣＲ反應(yīng)體系，分別加入豬瘟和非洲豬瘟、口蹄疫、豬傳染性胃腸炎、豬繁殖與呼吸綜合征、豬水泡病及豬圓環(huán)病毒２型的模板進(jìn)行擴(kuò)增。

１．２．７靈敏度試驗(yàn)將１．２．４中制備的重組質(zhì)粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ（濃度為1.2×1010ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）梯度稀釋為１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，分別以每個(gè)梯度質(zhì)粒為模板，在熒光ＰＣＲ儀上反應(yīng)。

１．２．８穩(wěn)定性試驗(yàn)在多重ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入豬瘟１０５拷貝數(shù)的梯度和非洲豬瘟１０７拷貝數(shù)的梯度模板，做２０次重復(fù)。間隔３０ｄ再以此反應(yīng)體系和梯度模板做２０次重復(fù)。對(duì)兩次重復(fù)試驗(yàn)的Ｃｔ值用ＳＰＳＳ １３．０分析穩(wěn)定性。

１．２．９臨床樣品檢測(cè)將本研究中所建立的多重?zé)晒猓校茫曳椒▽?duì)２份本實(shí)驗(yàn)室保存的已知豬瘟陽(yáng)性血清和１２０份豬內(nèi)臟、豬鼻腔拭子及血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。

２結(jié)果

２．１豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

由圖１可看出，ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段大小基本一致。

２．２重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增結(jié)果

重組質(zhì)粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ的插入片段測(cè)序結(jié)果在ＮＣＢＩ經(jīng)ＢＬＡＳＴ比對(duì)后與ＧｅｎＢａｎｋ中序列同源性較高。由圖２可以看出，經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增的片段大小在預(yù)期目標(biāo)內(nèi)。

２．３引物、探針濃度的優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)在熒光ＰＣＲ儀上擴(kuò)增曲線的Ｃｔ值和熒光高度看，使用１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物、探針各１．５ μＬ的時(shí)，豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒都有良好的擴(kuò)增曲線。

２．4特異性試驗(yàn)結(jié)果

由圖３可以看出，本研究中的多重?zé)晒猓校茫曳磻?yīng)體系只針對(duì)豬瘟和非洲豬瘟有特異性擴(kuò)增，其他對(duì)照病毒無(wú)擴(kuò)增曲線。

２．5靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

由圖４可以看出，本研究所建立的多重?zé)晒猓校茫曳椒梢詸z測(cè)到最低１０1ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的模板濃度。

２．６穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

豬瘟的批次內(nèi)變異系數(shù)分別為２．５４％、１．７０％，批次間為２．１３％，兩次結(jié)果無(wú)顯著差異（Ｐ＞０．０５）；非洲豬瘟的批次內(nèi)變異系數(shù)分別為１．３４％、１．３０％，批次間為１．５６％，兩次結(jié)果無(wú)顯著差異（Ｐ＞０．０５），說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性良好。

２．７臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

２份豬瘟陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性（Ｃｔ＜３０），１２０份鼻腔拭子、豬內(nèi)臟和血清中出現(xiàn)３份豬瘟陽(yáng)性，陽(yáng)性率為２．５％，未發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟陽(yáng)性。

３討論

我國(guó)是豬瘟多發(fā)國(guó)家，目前雖然沒(méi)有非洲豬瘟的報(bào)道，但是建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)該病的監(jiān)測(cè)卻是不可或缺的。對(duì)于豬瘟和非洲豬瘟的診斷方法主要包括ＦＡＴ、ＥＬＩＳＡ，動(dòng)物接種試驗(yàn)及核酸檢測(cè)技術(shù)［４，５］。ＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ方法對(duì)病料要求要盡可能新鮮，否則會(huì)降低病毒鑒定的可能性，而且當(dāng)豬感染引起急性癥狀時(shí)短時(shí)間內(nèi)機(jī)體往往難以產(chǎn)生足夠的抗體，這樣就可能會(huì)誤判。動(dòng)物接種試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，花費(fèi)較大而且會(huì)引起動(dòng)物福利問(wèn)題，所以ＯＩＥ不推薦使用該法。ＴａｑＭａｎ探針熒光定量ＰＣＲ是通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化來(lái)定性、定量分析的一種實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析方法［６］，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)及整個(gè)反應(yīng)只需一次加樣且污染性小的優(yōu)點(diǎn)。

本研究中豬瘟和非洲豬瘟引物和探針的設(shè)計(jì)選擇在各自基因高度保守區(qū)域內(nèi)，最大程度上降低不同毒株之間的特異性，避免病原的漏檢。由于建立的是多重?zé)晒猓校茫?，所以在設(shè)計(jì)引物探針時(shí)還要避免兩種病原引物探針間不能產(chǎn)生二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。同時(shí)，對(duì)豬瘟和非洲豬瘟的引物和探針最佳濃度比例做了優(yōu)化，確保兩套引物探針在同一個(gè)體系中發(fā)揮最佳作用。在特異性試驗(yàn)中，能夠?qū)⒇i瘟和非洲豬瘟同口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒及圓環(huán)病毒２型區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明本研究所建立的多重?zé)晒猓校茫曳椒梢詫⒇i瘟病毒和非洲豬瘟病毒同豬類易感的其他病毒區(qū)分開(kāi)。李維彬等［７］在ＴａｑＭａｎ探針檢測(cè)非洲豬瘟方法中報(bào)道該方法可以檢測(cè)到１００個(gè)拷貝數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)中變異系數(shù)在２．１３％~３．６２％之間。張倩［８］在非洲豬瘟病毒和古典豬瘟病毒雙重?zé)晒猓校茫覚z測(cè)方法中報(bào)道該研究可以檢測(cè)到非洲豬瘟的１０個(gè)拷貝數(shù)、豬瘟的１００個(gè)拷貝數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中建立的方法對(duì)豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒的檢測(cè)底限都可以達(dá)到１０拷貝數(shù)的數(shù)量級(jí)，而且方法穩(wěn)定，變異系數(shù)均小于３％。另外，Ｒｉｓａｔｔｉ等［９］報(bào)道，熒光ＰＣＲ方法能夠于動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀前３～５ｄ檢測(cè)到豬瘟病毒，而且鼻腔拭子和扁桃體拭子的檢出時(shí)間也早于血液樣品?？梢?jiàn)，采用正確部位的臨床樣品也是早期檢測(cè)豬瘟病毒的關(guān)鍵?？傊?，本研究建立了可同時(shí)檢測(cè)豬瘟和非洲豬瘟的多重?zé)晒猓校茫曳椒?，靈敏度高，特異性強(qiáng)，有望在豬瘟和非洲豬瘟的病原普查、早期診斷以及防控措施中發(fā)揮作用。

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