大孔吸附樹脂分離石榴皮中安石榴苷工藝研究

劉迪，宋曉宇，李婧，尚華

（1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織服裝學(xué)院，陜西咸陽712000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司，陜西西安710100）

大孔吸附樹脂分離石榴皮中安石榴苷工藝研究

劉迪1，宋曉宇2，李婧1，尚華1

（1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織服裝學(xué)院，陜西咸陽712000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司，陜西西安710100）

采用大孔吸附樹脂分離石榴皮中安石榴苷。對比吸附率和解吸率，篩選大孔吸附樹脂；考察梯度洗脫和等度洗脫分離純化效果，選擇分離方式；通過單因素試驗，確定分離純化參數(shù)。試驗結(jié)果顯示：選用LX-3010樹脂在長徑比為5∶1樹脂柱中以等度洗脫方式分離純化可以得到較高的安石榴苷提取量。單因素結(jié)果顯示，樹脂分離條件為：吸附液濃度2.0 mg/mL，吸附時間30 min，吸附流速1.5 mL/min；洗脫乙醇濃度40%，洗脫時間180 min，洗脫流速1.5 mL/min。在此條件下，可以得到純度為80.12%的安石榴苷純化產(chǎn)物。

石榴皮；安石榴苷；大孔吸附樹脂；分離

石榴皮為石榴科植物石榴（Punica granatumL.）的皮，我國南北都有栽培，以江蘇、河南等地較多，將其干燥后可入藥，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲之功效，常用于久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、帶下、蟲積腹痛[1-2]。然而，以石榴為原料的生產(chǎn)加工企業(yè)，石榴皮通常作為加工廢料低價處理，并沒有對這一寶貴資源進行再次加工利用。石榴果皮中含有多種功效成分，如鞣質(zhì)、安石榴苷、石榴皮堿、偽石榴皮堿、異石榴皮堿、沒食子酸等[3-6]。其中，安石榴苷（punicalagin）為石榴皮中主要活性成分，屬于多酚類物質(zhì)，分子式為C48H28O30，具有較強的抗氧化作用，在食品、日化、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7-11]。

本研究以安石榴苷為分離目標(biāo)，選用安全無毒的乙醇溶劑提取石榴皮中的安石榴苷，應(yīng)用大孔吸附樹脂[12-14]分離安石榴苷?？疾觳煌吞枠渲⒉煌疵摲绞綄Ψ蛛x效果的影響，應(yīng)用單因素試驗確定樹脂分離條件，以期為石榴皮深度加工和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴皮粉：市場上購買陜西西安市臨潼區(qū)石榴，洗凈，去皮，置于50℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎過100目篩，封口袋封裝后避光保存；安石榴苷標(biāo)準品（含量＞98%，CAS編號65995-63-3）：成都曼思特生物科技有限公司；磷酸（優(yōu)級純）、乙腈（色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；LX-620、LX-280、LX-1010、LX-3010 樹脂：西安藍曉科技新材料股份有限公司；40 mm×200 mm（長徑比為5∶1）聚四氟活塞層析柱：天長市東宏實驗儀器廠；試驗用水為18.25 MΩ超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機：鶴壁市恒科儀器儀表有限公司；DHG-9030電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；AL204型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BT100-1L恒流泵：蘭格恒流泵有限公司；P230型高效液相色譜系統(tǒng)：大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 安石榴苷粗提液的制備

取一定量石榴皮粉，與60%乙醇按照料液比為1 ∶25（g/mL）的比例混合，在 60℃條件下提取 6 h，抽濾兩次，合并濾液，將濾液在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，制備不同濃度的安石榴苷粗提液，作為樹脂上柱液使用。

1.3.2 安石榴苷測定

按照文獻[15]所述高效液相色譜（HPLC）檢測方法測定安石榴苷。色譜條件為：色譜柱為Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 30℃，紫外檢測器，波長378 nm，流動相為0.1%的磷酸水溶液（A液）和0.1%的磷酸乙腈溶液（B液），線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進樣量 10 μL。梯度洗脫程序：0～10 min 5%～40%B，10 min～20 min 40%～55%B，20 min～25 min 55%～60%B，25 min～30 min 60%～90%B，30 min～35 min 90%～5%B，35 min～45 min 5%B[15]。

1.3.3 樹脂型號篩選試驗

按照樹脂產(chǎn)品說明書要求，對樹脂進行預(yù)處理。取 LX-620、LX-280、LX-1010、LX-3010 樹脂各 20 g，加入0.1 mg/mL安石榴苷粗提液30 mL，20℃振蕩吸附12 h，抽濾，測定濾液安石榴苷濃度，計算各樹脂吸附率；將過濾后的樹脂分別用30 mL20%乙醇溶液在20℃振蕩解吸12 h，抽濾，測定濾液安石榴苷濃度，計算各樹脂解吸率。

1.3.4 洗脫方式選擇試驗

1.3.4.1 等度洗脫試驗

樹脂型號由1.3.3確定，取預(yù)處理好的樹脂100mL，濕法裝柱，將濃度為2.0 mg/mL安石榴苷粗提液分別以1 mL/min的速度流過樹脂柱，吸附60 min，用水、20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液分別以1 mL/min的速度洗脫，每15 min收集一次洗脫液，HPLC法檢測各洗脫液中安石榴苷濃度，確定各洗脫液的最佳洗脫時間并計算安石榴苷總提取量。每次洗脫完畢后，將樹脂進行再生處理。

1.3.4.2 梯度洗脫試驗

樹脂型號由1.3.3確定，取預(yù)處理好的樹脂100mL，濕法裝柱，將濃度為2.0 mg/mL的安石榴苷粗提液以1 mL/min的速度流過樹脂柱，吸附60 min，依次用水、20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液各200 mL以1 mL/min的速度洗脫，每15 min收集一次洗脫液，HPLC法檢測各洗脫液中安石榴苷濃度，計算安石榴苷總提取量。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 樹脂吸附單因素試驗

依次考察吸附流速、吸附液濃度、吸附時間3個因素變化對安石榴苷吸附效果的影響，制備2.0 mg/mL安石榴苷粗提液，分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的速度流過樹脂柱，吸附60 min；分別制備1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL不同濃度安石榴苷粗提液，分別以1 mL/min的速度流過樹脂柱，吸附60 min；制備2.0 mg/mL安石榴苷粗提液，以1 mL/min的速度流過樹脂柱，15、30、45、60、75 min 收集一次吸附后溶液。分別收集各單因素試驗吸附后溶液，HPLC法測定安石榴苷濃度，計算吸附后溶液安石榴苷濃度或吸附率。

1.3.5.2 樹脂洗脫單因素試驗

按照1.3.5.1試驗結(jié)果對安石榴粗提液進行吸附，依次考察洗脫流速、洗脫時間、乙醇濃度3個因素變化對安石榴苷洗脫效果的影響，用40%乙醇溶液，分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 的速度流過樹脂柱，洗脫180 min；用40%乙醇溶液，以1 mL/min的速度進行洗脫，分別洗脫 60、90、120、150、180、210 min；分別用水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液以1 mL/min流速進行洗脫，洗脫120 min。分別收集各單因素試驗洗脫后溶液，HPLC法測定洗脫后溶液安石榴濃度，計算洗脫率。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每項試驗平行做3次，試驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（mean±S.D.）表示；高效液相色譜圖數(shù)據(jù)用Sigmaplot 10.0軟件處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 安石榴苷色譜分析

按照文獻[15]所述方法，安石榴苷標(biāo)準品和安石榴苷粗提物高效液相檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，圖中α和β分別為安石榴苷有兩種同分異構(gòu)體。

圖1 安石榴苷標(biāo)準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of punicalagin standard

圖2 安石榴苷粗提物高效液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of punicalagin extract

2.2 樹脂型號篩選結(jié)果

樹脂型號篩選結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，LX-3010型號樹脂的吸附率最高，達到83.68%；LX-280和LX-3010型號樹脂的解吸率相當(dāng)，分別為59.99%和59.36%。綜合考慮吸附率和解吸率，選擇LX-3010型號樹脂作為分離純化樹脂。

2.3 洗脫方式選擇試驗結(jié)果

2.3.1 等度洗脫試驗結(jié)果

等度洗脫試驗結(jié)果如圖4所示，色譜圖為安石榴苷濃度最高時間段所收集洗脫液HPLC分析圖。

圖3 不同型號樹脂對安石榴苷的吸附率和解析率Fig.3 Adsorption rate and desorption rate of different type resin on punicalagin

圖4 等度洗脫試驗結(jié)果Fig.4 The result of isocratic elution test

圖4顯示，不同洗脫液進行洗脫時，能夠?qū)彩褴障疵摑舛冉档?.1 mg/mL的時間有所差異，水為150 min，20%乙醇為 555 min，40%乙醇為 150 min，60%、80%和100%乙醇均為180 min。各洗脫液HPLC色譜圖顯示，水、20%乙醇、40%乙醇和60%乙醇洗脫液中雜峰較少，其中水洗脫液安石榴苷濃度最低；80%乙醇和100%乙醇洗脫液中雜峰較多。

2.3.2 梯度洗脫試驗結(jié)果

梯度洗脫試驗結(jié)果如圖5所示。

各洗脫液HPLC圖譜顯示，40%乙醇梯度洗脫液中雜峰最少，水和60%乙醇梯度洗脫液中雜峰最多，100%乙醇梯度洗脫液中安石榴苷峰面積最小，且在水、60%、80%、100%乙醇梯度洗脫液中，分別出現(xiàn)了一個較大的峰a，并隨著乙醇濃度的增大，該峰的峰高越高。

圖5 梯度洗脫試驗結(jié)果Fig.5 The result of gradient elution test

2.3.3 不同洗脫方式安石榴苷提取量比較

不同洗脫方式安石榴苷提取量比較結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同洗脫方式安石榴苷提取量Fig.6 Punicalagin extraction mass by different elution mode

由圖可以看出，等度洗脫中，20%～100%乙醇洗脫液得到安石榴苷提取量相當(dāng)，分別為160.25、164.10、163.98、162.87、162.99 mg，水洗脫得到的安石榴苷量最少，僅為14.17 mg；而梯度洗脫中，各洗脫液濃度結(jié)果顯示，20%乙醇梯度洗脫液得到的安石榴苷濃度最高，其次為40%乙醇梯度洗脫液，濃度最低的為100%乙醇梯度洗脫液。總的安石榴苷提取量為158.04 mg，與每個等度洗脫液得到的安石榴苷量相當(dāng)。

從安石榴苷提取總量考慮，等度洗脫純化可以得到較多的安石榴苷，且梯度洗脫步驟較繁瑣，操作費時，工業(yè)化操作成本較高，因此，選擇等度洗脫為安石榴分離純化操作方式。

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 樹脂吸附單因素試驗

樹脂單因素試驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 樹脂吸附單因素試驗結(jié)果Fig.7 The result of single-factor experiment for resin absorption

吸附流速單因素試驗結(jié)果顯示，流速在0.5mL/min～1.5 mL/min吸附率逐漸上升，當(dāng)流速為1.5mL/min時，吸附率最大；流速在1.5 mL/min～3.0 mL/min吸附率逐漸降低。吸附液濃度單因素試驗結(jié)果顯示，吸附液濃度在1.0 mg/mL～2.0 mg/mL吸附率逐漸上升，當(dāng)濃度為2.0 mg/mL時，吸附率最大；濃度大于2.0 mg/mL吸附率逐漸降低。吸附時間單因素試驗結(jié)果顯示，吸附30 min后的溶液中安石榴苷濃度變大，75 min時吸附后溶液與吸附前溶液濃度相當(dāng)。綜合分析，確定樹脂吸附工藝條件為：吸附液濃度2.0 mg/mL，吸附時間30 min，吸附流速1.5 mL/min。

2.4.2 樹脂洗脫單因素試驗

樹脂單因素試驗結(jié)果如圖8所示。

圖8 樹脂洗脫單因素試驗結(jié)果Fig.8 The result of single-factor experiment for resin elution

洗脫流速單因素試驗結(jié)果顯示，流速在0.5mL/min～1.5 mL/min洗脫率逐漸上升，當(dāng)流速為1.5 mL/min時，洗脫率最大；流速在1.5 mL/min～3.0 mL/min洗脫率逐漸降低。時間單因素試驗結(jié)果顯示，洗脫時間在60min～180 min洗脫率逐漸上升，當(dāng)洗脫時間為180 min時，洗脫率最大，大于180 min時洗脫率基本沒有變化。乙醇濃度單因素試驗結(jié)果顯示，乙醇濃度在0%～40%洗脫率逐漸上升，當(dāng)濃度為40%時，洗脫率最大；濃度在40%～100%洗脫率逐漸降低。綜合分析，確定樹脂洗脫工藝條件為：洗脫乙醇濃度40%，洗脫時間180 min，洗脫流速1.5 mL/min。

在確定的大孔吸附樹脂分離條件下，對分離后的安石榴苷產(chǎn)品濃縮、凍干，平行操作3次，HPLC測定其中安石榴苷含量平均值為80.12%。

3 結(jié)論

通過比較不同型號的大孔吸附樹脂對安石榴苷的吸附率和解吸率，篩選大孔吸附樹脂；對比等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫效果，選擇合適的洗脫方式；應(yīng)用單因素試驗，確定樹脂吸附和洗脫條件。最后，確定大孔樹脂分離安石榴苷工藝條件為：將LX-3010樹脂裝填在長徑比為5∶1樹脂柱內(nèi)，制備安石榴苷濃度為2.0 mg/mL的石榴皮粗提物上柱液，在吸附時間30 min、吸附流速為1.5 mL/min的條件下進行吸附，再用40.00%乙醇，以1.5 mL/min洗脫流速進行洗脫，洗脫180.00 min。在此工藝條件下，可以得到純度為80.12%的安石榴苷純化產(chǎn)物。本研究得到的最優(yōu)工藝路線，可為石榴皮中安石榴苷的分離純化提供技術(shù)支持，也為石榴皮的綜合利用提供參考。

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Study on Processing of Separation for Punicalagin from Pomegranate Husk by Macroporous Adsorption Resin

LIU Di1，SONG Xiao-yu2，LI Jing1，SHANG Hua1
（1.Department of Chemical Engineering and Textile，Shaanxi Polytechnic Institute，Xianyang 712000，Shaanxi，China；2.Shaanxi Haisheng Fresh Fruit Juice Co.，Ltd.，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

Macroporous adsorption resin was used to separate punicalagin from pomegranate husk.By comparing the adsorption rate and desorption rate，the macroporous adsorption resin was screened；by investigating gradient elution and isocratic elution on effect of separation and purification，separation mode was chosen；by using single-factor test，the parameters for separation confirmed.The result showed that the more punicalagin could be gotten by using LX-3010 resin in column of which the ratio of length to diameter was 5∶1 by isocratic elution.Single-factor test result showed the optimization condition for separation was：the content，the time，and the flow rate for adsorption were 2.0 mg/mL，30 min，and 1.5 mL/min；the content of ethnol，the time，and the flow rate for elution were 40%，180 min，and 1.5 mL/min，respectively.The punicalagin with purity of 80.12%was achieved under the condition.This processing could be a reference for comprehensive utilization of pomegranate husk.

pomegranate husk；punicalagin；macroporous adsorption resin；separation

2016-12-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.010

陜西省科技廳工業(yè)科技攻關(guān)項目（2015GY165）

劉迪（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：化學(xué)新材料的制備，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。