后溝堡子酒酒曲優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的初步分離與鑒定

趙文婧　石瑛　王瑞祥　單樹花

摘要：從山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒曲樣品中初步分離純化出2株細(xì)菌XJ1和XJ2，通過形態(tài)觀察以及生理生化反應(yīng)分析得出，XJ1白色、中等大小、圓形、菌落呈放射狀，XJ2呈乳白色、形狀規(guī)則、表面呈粉末狀、較致密。通過生理生化試驗(yàn)得出，兩株細(xì)菌的吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)同呈陽(yáng)性，兩株細(xì)菌均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖，XJ1革蘭氏染色呈陽(yáng)性，XJ2革蘭氏染色呈陰性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可以得出這兩株菌株分別是乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：堡子酒；大曲；細(xì)菌；分離

中圖分類號(hào)：Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4604-03

酒類是中國(guó)第一大類發(fā)酵食品，現(xiàn)在人們視高度白酒為慎用食品，而低度、開胃助消化、營(yíng)養(yǎng)豐富且具有保健功能的釀造酒已成為人們追求的目標(biāo)。用曲釀酒是中國(guó)酒的特色，在世界釀酒史上獨(dú)樹一幟，是中國(guó)的一項(xiàng)偉大發(fā)明[1]。日本著名釀酒專家板口謹(jǐn)一郎先生曾經(jīng)評(píng)論，中國(guó)發(fā)明酒曲釀酒，其影響之大，堪與中國(guó)四大發(fā)明相比[2]。在現(xiàn)代大致將酒曲分為五大類，麥曲、小曲、紅曲、大曲、麩曲，分別用于制作不同的酒。探索酒曲發(fā)酵的奧妙，從而揭示其釀酒發(fā)酵機(jī)理，以利于更有效地指導(dǎo)生產(chǎn)，進(jìn)行質(zhì)量控制，改良酒體風(fēng)格[3]。

縱觀世界各國(guó)的釀酒史發(fā)現(xiàn)，用谷物原料釀酒的技術(shù)主要有兩大類，一類是以谷物發(fā)芽的方式，利用谷物發(fā)芽時(shí)產(chǎn)生的酶將原料本身糖化成糖分，再用酵母菌將糖分轉(zhuǎn)變成酒精；另一類是用發(fā)霉的谷物制成酒曲，用酒曲中所含的酶制劑將谷物原料糖化發(fā)酵成酒。傳統(tǒng)的酒曲本質(zhì)之一就是粗酶制劑，但傳統(tǒng)的酒曲的最大缺點(diǎn)是酶活較低。在現(xiàn)代由于酶制劑工業(yè)的發(fā)展，在酒的生產(chǎn)過程中適當(dāng)加入一部分酶制劑以代替部分傳統(tǒng)酶制劑的使用可降低酒的生產(chǎn)成本，但所產(chǎn)生的問題是酒的香味受到一定的影響。

白酒生產(chǎn)微生物是影響產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)格的重要因素之一，不同區(qū)域的地理環(huán)境存在眾多不同的微生物菌群。淡雅濃香型白酒應(yīng)有己酸乙酯為主的復(fù)合香氣，凸顯幽雅飄逸感，口味應(yīng)努力做到綿柔、醇和、回甜、爽凈，具有舒適感；在風(fēng)格上注重色、香、味的自然諧調(diào)感，具有獨(dú)特淡雅的風(fēng)格。白酒生產(chǎn)技術(shù)是中國(guó)勞動(dòng)人民和科學(xué)工作者對(duì)世界釀酒工業(yè)的特殊貢獻(xiàn)。其獨(dú)特的多種微生物固態(tài)發(fā)酵釀酒、甑桶蒸餾及其生產(chǎn)工藝形成了白酒的各種風(fēng)格[4]。白酒的特殊風(fēng)味來(lái)源于參與白酒發(fā)酵的微生物種類和數(shù)量的多寡，謂之“曲者，酒之骨也?！贬劸圃显谖⑸锏淖饔孟律筛鞣N呈香味物質(zhì)，所以微生物的種類又是關(guān)鍵因素。由于微生物之間存在著互生、共生、寄生、拮抗的關(guān)系，在白酒生產(chǎn)過程中逐漸形成一個(gè)靠自然給予、異常復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系。這種區(qū)系的存在在很大程度上決定白酒的風(fēng)格。

本研究采用的酒曲樣品來(lái)源于山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒廠。該酒廠以當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的高粱為主料，谷糠為輔料，大麥、豌豆踩制的大曲為糖化發(fā)酵劑，利用地缸固體分離發(fā)酵和清蒸二次傳統(tǒng)工藝進(jìn)行釀造，釀制出了原有風(fēng)味的堡子酒。大曲中含有細(xì)菌、霉菌、酵母菌等多種微生物，因此發(fā)酵過程極為復(fù)雜，各種微生物的生理性能不同，其作用也各異。探討堡子酒酒曲中細(xì)菌的生化活性，通過微生物平板分離純化技術(shù)，采用稀釋、涂布、恒溫培養(yǎng)、生理生化等試驗(yàn)，對(duì)酒曲中的細(xì)菌進(jìn)行初步分離鑒定，從而揭示堡子酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌種類，為優(yōu)化酒質(zhì)量，改善酒質(zhì)，提高堡子酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)堡子酒系列新品種提供參考。

對(duì)于國(guó)內(nèi)研究酒曲細(xì)菌分離和鑒定的試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，堡子酒的研究屬于首例，對(duì)于堡子酒本身來(lái)說(shuō)填補(bǔ)了其空白，為堡子酒品質(zhì)的提高提供依據(jù)；另一方面堡子酒屬于清香型白酒，它和汾酒同屬一個(gè)系列，該項(xiàng)研究提升堡子酒本身價(jià)值的同時(shí)，也為國(guó)內(nèi)清香型白酒的研究做了一定的補(bǔ)充。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料后溝堡子酒酒曲由山西省晉中市榆次區(qū)后溝堡子酒酒廠提供。

1.1.2儀器與設(shè)備海爾HRCJ-2D型無(wú)菌操作臺(tái)、海爾HRSP-250H型恒溫培養(yǎng)箱和海爾搖床購(gòu)自上海富眾生物科學(xué)有限公司，CL-32L型滅菌鍋購(gòu)自日本ALP，MP4002型電子天平購(gòu)自上海恒平科學(xué)儀器有限公司，H5-1型磁力加熱攪拌器購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司。酒精燈、接種環(huán)、研缽、紗布、棉花、繩子、三角玻璃棒、1 000 mL燒杯、中號(hào)試管、9 cm培養(yǎng)皿、500 mL錐形瓶、1 mL移液管、玻璃珠、德漢氏小管。

1.1.3試劑牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蔗糖、半乳糖、淀粉、甲基紅、乙醚、對(duì)甲基苯甲醛、濃鹽酸、溴甲酚紫、無(wú)水乙醇、95%乙醇、碘化鉀、碘均為分析純。

1.1.4固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.4～7.6；淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、可溶性淀粉2 g、氯化鈉

5 g、瓊脂15～20 g、牛肉膏5 g，用去離子水定容至

1 000 mL，pH 7.2；糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、半乳糖10 g、16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，用去離子水定容到

1 000 mL，pH 7.4；吲哚培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉

5 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.6；甲基紅（MR）培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀5 g、葡萄糖

5 g，用去離子水定容到1 000 mL，pH 7.2～7.4；蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g，用去離子水定容到100 mL，pH 7.8；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g，用去離子水定容到100 mL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離與鑒定的流程榆次后溝堡子酒酒曲中細(xì)菌分離與鑒定的流程如下：酒曲菌懸液→平板分離→菌種純化→生理生化試驗(yàn)→鑒定→檢索→結(jié)論。

1.2.2菌懸液的制備稱取樣品1 g，加入到裝有9 mL無(wú)菌去離子水的錐形瓶?jī)?nèi)（內(nèi)有小玻璃珠），用搖床振蕩20 min，菌懸液即制備完成。

1.2.3細(xì)菌的分離純化

1）梯度濃度菌懸液的制備。用無(wú)菌吸管從菌懸液中吸取1 mL菌液，加入到裝有9 mL無(wú)菌去離子水的試管中充分混勻，然后從該試管中吸取1 mL菌液加入到另一支裝有9 mL無(wú)菌去離子水的試管中，混合均勻，依此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、

10-5、10-6不同稀釋梯度的菌懸液。

2）細(xì)菌的分離。細(xì)菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[5]，取不同梯度的菌懸液0.1 mL，分別加入到無(wú)菌平板中，用涂布棒涂勻，使樣品溶液在培養(yǎng)基上分布均勻。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約24 h至長(zhǎng)出菌落[5]。

3）細(xì)菌的純化。用接種環(huán)按無(wú)菌操作法分別從平板培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)不同形態(tài)的菌落，在新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離，分別放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。重復(fù)以上操作至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落為止，將純化得到的菌種進(jìn)行編號(hào)并分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)菌的鑒定根據(jù)經(jīng)典微生物分類法[6]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，主要是依據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步分類，并對(duì)菌種的形態(tài)特征（如群體特征和個(gè)體特征）和生理生化特征進(jìn)行鑒定[7]。

1）細(xì)菌的群體形態(tài)學(xué)觀察[8，9]。細(xì)菌的培養(yǎng)特征是指細(xì)菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性，主要觀察菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質(zhì)地、邊緣情況及隆起情況等，并記錄結(jié)果。

2）細(xì)菌個(gè)體形態(tài)的觀察。在高倍鏡及油鏡下分別對(duì)獲得的單一菌株的個(gè)體形態(tài)、大小、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性、鞭毛的有無(wú)等進(jìn)行觀察[10]，并記錄結(jié)果。

3）細(xì)菌生理生化反應(yīng)的觀察。主要觀察細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)源利用情況，代謝特征，能否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣以及生長(zhǎng)發(fā)育條件等，對(duì)純化的菌株進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)[10，11]等檢測(cè)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離結(jié)果

從堡子酒酒曲中分離并純化出2株細(xì)菌，分別命名為XJ1和XJ2，主要用于觀察兩株細(xì)菌菌落的形狀、顏色、大小、透明度、光澤質(zhì)地、邊緣情況及隆起情況等。

2.2細(xì)菌的鑒定結(jié)果

2.2.1細(xì)菌菌落形態(tài)鑒定結(jié)果由表1可知，酒曲中的細(xì)菌分別為白色和乳白色兩種，XJ1半透明、菌落呈放射狀，XJ2表面呈粉末狀、較致密。

2.2.2細(xì)菌個(gè)體形態(tài)鑒定結(jié)果由表2可知，XJ1為革蘭氏陽(yáng)性菌，XJ2為革蘭氏陰性菌；兩株細(xì)菌的形狀均為桿狀且都有莢膜；XJ1無(wú)芽孢，XJ2有芽孢。

2.2.3細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各項(xiàng)生理生化測(cè)定，所得結(jié)果見表3和表4。XJ1和XJ2的吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性，MR試驗(yàn)均為陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)中XJ1為陰性、XJ2為陽(yáng)性，糖發(fā)酵試驗(yàn)中XJ1和XJ2均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖。

3小結(jié)與討論

該研究通過對(duì)后溝堡子酒酒曲進(jìn)行分析處理、稀釋培養(yǎng)、分離純化后，根據(jù)菌種鑒定文獻(xiàn)[5，12]鑒定得到2株細(xì)菌XJ1和XJ2。

生理生化反應(yīng)當(dāng)中，兩株細(xì)菌均能利用葡萄糖和半乳糖作為碳源，但均不能利用蔗糖作為碳源，這說(shuō)明不同的細(xì)菌能通過分解不同的糖類來(lái)獲取其生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。兩株細(xì)菌在分解葡萄糖和半乳糖時(shí)均只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣。兩株細(xì)菌在進(jìn)行吲哚試驗(yàn)時(shí)均能產(chǎn)生色氨酸酶，它可以分解蛋白胨中的色氨酸，從而產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。XJ1對(duì)淀粉無(wú)分解能力，而XJ2對(duì)淀粉有分解能力。

根據(jù)其形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]可初步檢索得出2株菌株的所屬菌屬，XJ1為乳酸桿菌屬，XJ2為芽孢桿菌屬。

酒中的眾多香味成分來(lái)源于細(xì)菌代謝[14，15]。此次試驗(yàn)初步得出了酒曲中細(xì)菌的種類，為優(yōu)化酒質(zhì)量，改善酒質(zhì)，提高堡子酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)堡子酒系列新品種提供了科學(xué)根據(jù)。堡子酒和山西汾酒同屬清香型白酒，國(guó)內(nèi)對(duì)汾酒的研究已非常廣泛，而堡子酒尚屬首例，本研究填補(bǔ)了堡子酒研究的空白，并可以充實(shí)和完善山西清香型白酒的系統(tǒng)研究。

對(duì)酒曲中存在的細(xì)菌進(jìn)行了研究，涉及其分離純化和初步鑒定，并確定到屬。在以后的研究中將采用分子生物學(xué)方法對(duì)未知菌進(jìn)行進(jìn)一步的菌種鑒定。通過對(duì)微生物的16 S rDNA序列分析等，從基因水平對(duì)酒曲微生物進(jìn)行定性和定量研究，直接、微觀地探討微生物種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及其與環(huán)境間的相互關(guān)系，對(duì)酒曲進(jìn)行更深層次的研究，為酒曲生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] 榮瑞金，李祖明，王德良，等.中國(guó)酒曲微生物研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2009（6）：5-8.

[2] 傅金全.中國(guó)酒曲技術(shù)的發(fā)展與展望[J].釀酒，2002，29（2）：7-9.

[3] 施安輝.濃香型白酒發(fā)酵過程窖中微生物區(qū)系的分析[J].釀酒，1986，13（4）：24-29.

[4] 沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.29-32.

[5] 沈萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1999.

[6] 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定[M].北京：科學(xué)出版社，1978.

[7] 王大耜.細(xì)菌分類基礎(chǔ)[M].北京：科學(xué)出版社，1977.

[8] 王麗，韓建榮，趙景龍，等.汾酒曲醅中產(chǎn)高溫蛋白酶芽孢桿菌的分離[J].中國(guó)釀造，2009（1）：67-69.

[9] 普雷沃·安德烈·羅曼.細(xì)菌學(xué)概論[M].劉自溶，譯.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1981.115-136，150-166.

[10] 杜連祥，路福平.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005.

[11] 陳曉明，魏寶麗，張建國(guó).短小芽孢桿菌E601傳代和中子輻照后的菌落形態(tài)變化[J].核農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，22（3）：291-295.

[12] 蔡妙英.芽孢桿菌屬[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1983.

[13] BUCHANA N R E，GIBBO N E E N. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，譯.北京：科學(xué)出版社，1984. 797-830.

[14] 萬(wàn)自然. 大曲培養(yǎng)過程中微生物及酶的變化[J].釀酒科技，2004（4）：25-26.

[15] ZHANG W X，QIAO Z W，TANG Y Q，et al. Analysis of the fungal cornmunity in Zaopei during production of Chinese Luzhou-flavor liquor[J]. J Inst Brew，2007，113（1）：21-27.