鴨大腸桿菌病區(qū)域優(yōu)勢血清型疫苗研究報告(Ⅰ報)

羅玲 楊峻 邵華斌 王紅琳 羅青平 溫國元 張蓉蓉 艾地云 羅明杰

摘要：用鑒定篩選的大腸桿菌接種適宜培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物經(jīng)甲醛溶液滅活后，分別制備氫氧化鋁膠滅活疫苗、油乳劑滅活疫苗，經(jīng)檢驗(yàn)合格，用于安全和效力試驗(yàn)，比較兩種佐劑制備的滅活疫苗的免疫效力。結(jié)果表明，氫氧化鋁膠作為佐劑制備區(qū)域優(yōu)勢血清型疫苗來預(yù)防本地的鴨大腸桿菌病效果更好。

關(guān)鍵詞：鴨大腸桿菌病滅活疫苗；佐劑；免疫效果

中圖分類號：Ｓ８５８．３２文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0013-0

禽大腸桿菌是一種潛在的人畜共患病病原［１］，鴨大腸桿菌病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于鴨大腸桿菌的耐藥日趨嚴(yán)重，疫苗免疫成為預(yù)防該病的有效手段，但大腸桿菌病流行廣泛，其血清型眾多，不同地區(qū)差異較大，國內(nèi)外還沒有有效的疫苗來防治該病，所以用本地分離鑒定和篩選的病原菌株來制備多價滅活疫苗對預(yù)防該地的鴨大腸桿菌病效果更好。本研究選用從湖北省分離鑒定篩選的３株疫苗菌株制備氫氧化鋁膠滅活疫苗，經(jīng)安全性、免疫效力試驗(yàn)證明此疫苗效果較理想。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

１．１．１試驗(yàn)用菌種試驗(yàn)用菌種及效力檢驗(yàn)用強(qiáng)毒均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存和提供。

１．１．２試驗(yàn)鴨為地方麻鴨，購買后飼養(yǎng)觀察７ｄ無異常，即用于后續(xù)試驗(yàn)。

１．２試驗(yàn)用疫苗制備與檢驗(yàn)

１．２．１制苗用菌液的制備用玻璃瓶或培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入７０％培養(yǎng)基及花生油消沫劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的２％～４％接種各菌株混合的二級種子液，各菌株種子混合比例為ＥＣ７８∶ＥＣ４５∶ＥＣ８為１∶１∶１。開始小量通氣，逐漸增大氣量，３６～３７℃培養(yǎng)１０～１４ｈ。菌液培養(yǎng)完成后取樣作純粹檢驗(yàn)［２］（應(yīng)達(dá)到純粹標(biāo)準(zhǔn)）。同時活菌計(jì)數(shù)［２］，每毫升活菌應(yīng)不低于１５億個。按０．４％加入甲醛溶液，經(jīng)３８℃滅活４８～７２ｈ，期間每隔４～６ｈ振搖一次，作滅活檢驗(yàn)［２］。

１．２．２疫苗的制備

１．２．２．１氫氧化鋁膠滅活疫苗的制備每５份菌液加１份氫氧化鋁，同時按總量的０．００５％加硫柳汞，充分振蕩，于２～８℃靜置２～３ｄ，抽棄上清濃縮成全量的６０％，于２～８℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２．２油乳劑滅活疫苗的制備

油相制備：注射用白油９４份、司本－８０ ６份、硬脂酸鋁２份，配油相時，先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化，再與全量司本－８０及注射用白油混合均勻，１１６℃滅菌３０ｍｉｎ，備用。

水相制備：吐溫－８０ ４份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加入菌液９６份，充分振搖，使吐溫－８０完全溶解為止。

乳化：取油相３份放于膠體磨內(nèi)，慢速轉(zhuǎn)動攪絆，同時緩慢加入水相１份，加完后再以１０ ０００ｒ／ｍｉｎ攪拌２～５ｍｉｎ，在終止前加入１％硫柳汞溶液使其最終濃度為０．００５％。乳化后，?。场担恚桃裕?０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重復(fù)攪拌１次。

１．２．３疫苗的檢驗(yàn)對制備的疫苗進(jìn)行無菌、安全性和效力檢驗(yàn)。

１．２．３．１無菌試驗(yàn)按文獻(xiàn)［２］介紹的方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

１．２．３．２疫苗的安全試驗(yàn)選?。敝荦g的健康易感鴨３０只，分３組，每組１０只。第１組采用制備的氫氧化鋁膠疫苗頸部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第２組采用油乳劑疫苗頸部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第３組頸部皮下或肌肉注射滅菌生理鹽水１ｍＬ／只。觀察１４ｄ。

１．３兩種佐劑疫苗免疫效果比較試驗(yàn)

選?。仓荦g健康易感鴨４０只，分４組，每組１０只。第１組每只頸部皮下接種氫氧化鋁膠滅活疫苗０．５ｍＬ，第２組每只肌肉注射氫氧化鋁膠滅活疫苗０．５ｍＬ，第３組每只頸部皮下接種油乳劑滅活疫苗０．５ｍＬ，第４組為對照組，不接種任何疫苗。免疫后２１ｄ，各組肌肉注射強(qiáng)毒株混合液０．５ｍＬ／只（含活菌２億～５億個），觀察１４ｄ，記錄每組健活數(shù)和死亡數(shù)，計(jì)算每種疫苗免疫攻毒保護(hù)率。

２結(jié)果與分析

２．１疫苗的無菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種佐劑制備的疫苗均無菌生長。

２．２疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果

由表１可見，兩種佐劑制備的疫苗免疫的７日齡雛鴨均健活，精神、食欲正常，迫殺剖檢無任何肉眼可見病變。

２．３兩種佐劑疫苗免疫效果試驗(yàn)結(jié)果

由表２可見，氫氧化鋁膠疫苗和油乳劑滅活疫苗免疫１４日齡的雛鴨，免疫保護(hù)率均不低于８０％，達(dá)到疫苗規(guī)定的要求。

３小結(jié)與討論

本試驗(yàn)用從湖北地區(qū)篩選的菌株制備氫氧化鋁膠滅活疫苗和油乳劑滅活疫苗，并進(jìn)行了安全性和免疫效果的比較試驗(yàn)。安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，用兩種佐劑制備的疫苗免疫鴨，試驗(yàn)鴨均健活。免疫效果試驗(yàn)結(jié)果油乳劑滅活疫苗和氫氧化鋁膠滅活疫苗可以達(dá)到同等的免疫保護(hù)率（不小于８０％），但是在用油乳劑滅活疫苗進(jìn)行免疫時部分雛鴨產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng)，氫氧化鋁膠滅活疫苗進(jìn)行免疫時雛鴨沒有應(yīng)激反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，選用氫氧化鋁膠作為佐劑制備區(qū)域優(yōu)勢血清型疫苗來預(yù)防本地的鴨大腸桿菌病效果更好。

參考文獻(xiàn)：

［１］卡爾尼克Ｂ Ｗ． 禽病學(xué)［Ｍ］．高福，劉文軍，主譯．第九版．北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，１９９１．４２７－４４４．

［２］中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典（２００５年版）［Ｍ］． 中國農(nóng)業(yè)出版社，２００５．