酵母細(xì)胞固定化實(shí)驗(yàn)的深度解析

曹麗

生物學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的自然科學(xué)，觀察和實(shí)驗(yàn)是生物科學(xué)教學(xué)的重要方法，是實(shí)施素質(zhì)教育的良好切入點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)已成為高中生物教學(xué)內(nèi)容中最重要的組成部分之一，同時(shí)也成為高考的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，現(xiàn)行高考不僅考書本實(shí)驗(yàn)，還考書外實(shí)驗(yàn)，不僅考實(shí)驗(yàn)的掌握應(yīng)用，還考實(shí)驗(yàn)的遷移。下面對(duì)酵母細(xì)胞固定化實(shí)驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容作一個(gè)深度解析。

1 酵母細(xì)胞固定化原理的深度解析

海藻酸鈉是由a-L-甘露糖醛酸(M單元)與b-D-古羅糖醛酸(G單元)依靠1,4-糖苷鍵連接形成的絲性共聚物，其分子為(C6H7NaO6Na)n，不同海澡酸鈉的M和G的比率和排列順序不同，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。由海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)式可知，海藻酸鈉含有很多游離的羧基和羥基，性質(zhì)活潑，這些基團(tuán)能與大多數(shù)二價(jià)或多價(jià)金屬離子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成不溶于水的褐藻酸金屬鹽，如海澡酸鈉與Ca2+形成海藻酸鈣的膠體。

圖2是海藻酸鈉和褐藻酸鈣凝膠的紅外光譜圖，圖中3 370~3 420 cm-1歸屬為褐藻酸鹽中－OH伸縮振動(dòng)峰，2 930 cm-1歸屬為C－H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，1540~1650 cm-1是褐藻酸羧基的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1 488~1 350 cm-1，是羧基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1 000~1 100 cm-1是吡喃糖環(huán)C－O伸縮振動(dòng)峰。由圖可以看出，褐藻酸鈉在成凝膠前后發(fā)生的最明顯的變化就是－OH峰的位置，成凝膠前－OH峰的波數(shù)為3 395 cm-1而成凝膠后為3 418 cm-1，成凝膠后向高波數(shù)方向偏移了23 cm-1，這些變化主要是因?yàn)楹衷逅徕c成凝膠后GG段與Ca2+形成了配位結(jié)構(gòu)，兩個(gè)羧基氧、一個(gè)環(huán)間氧和一個(gè)羥基氧參與了配位，由于羥基氧參與了配位降低了氫鍵締合程度使得－OH峰向高波數(shù)偏移。另外在2 930 cm-1處褐藻酸鈉在成凝膠之前C－H伸縮振動(dòng)吸收較強(qiáng)而成凝膠后C-H伸縮振動(dòng)吸收較弱，其原因在于褐藻酸鈉成凝膠后Ca2+與GG交聯(lián)形成的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)限制了六元環(huán)上C－H鍵的伸縮振動(dòng)，使得偶極矩變化較小，而吸收峰較弱。

此外，1 540~1 650 cm-1和1 488~1 350 cm-1吸收強(qiáng)度減弱，這主要是由于鈣的交聯(lián)形成了－CO－O－Ca－O－CO－基團(tuán)結(jié)構(gòu)。這充分表明褐藻酸鈉中羧基與Ca2+形成了螯合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而證明了海藻酸鈣分子是由Ca2+離子的交聯(lián)形成的網(wǎng)狀大分子。

將海藻酸鈉加入含鈣離子的介質(zhì)中，鈣離子將置換海藻酸鈉大分子中的部分氫離子和鈉離子而轉(zhuǎn)化為海藻酸鈣分子，反應(yīng)式為Ca2++HAlg+NaAlg＝Ca(Alg)2+H++Na+。故凝膠體中同時(shí)存在NaAlg、HAlg和Ca(Alg)2，這3種結(jié)構(gòu)相互交錯(cuò)連接，由于各自的結(jié)合力不同，導(dǎo)致整個(gè)海藻酸鈣凝膠大分子結(jié)構(gòu)的空間連接力亦不均衡，產(chǎn)生了較大的空隙，故可容納其它的分子或細(xì)胞（如酵母細(xì)胞）。

Ca2+在整個(gè)體系中起主導(dǎo)作用，有助于把分子連接在一起，這種作用形成了三維結(jié)構(gòu)，里斯把它稱作“雞蛋箱”結(jié)構(gòu)。這些功能基團(tuán)的變化為制備功能性海藻酸鈣凝膠提供理論依據(jù)，也是固定化酵母細(xì)胞的深層原理。

2 海藻酸鈣凝膠形成因素的深度解析

采用氯化鈣體系制作的海藻酸鈣凝膠，受氯化鈣濃度、溫度、海藻酸鈉的濃度影響較大，其中海藻酸鈉與氯化鈣的濃度是關(guān)鍵。馬萍老師在《海藻酸鈣凝膠微球的制備和pH依賴性溶脹》一文中指出，當(dāng)海藻酸鈉的濃度小于1％或氯化鈣的濃度大于0.02 mol·L-1時(shí)均不能滴制成球，而海藻酸鈉的濃度大于4％或氯化鈣濃度高于0.2 mol·L-1時(shí)，在凝膠的表面迅速形成致密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，阻礙了Ca2+向凝膠內(nèi)部的擴(kuò)散，使得內(nèi)部不能形成完整的凝膠結(jié)構(gòu)。當(dāng)氯化鈣溶液的溫度為50 ℃時(shí)，Ca2+和褐藻酸鈉的交聯(lián)程度最好。另外褐藻酸鈉分子中M/G對(duì)海藻酸鈣凝膠的性能有著重大的影響。

3 實(shí)驗(yàn)操作注意點(diǎn)的深度解析

（1） 海藻酸鈉濃度低會(huì)導(dǎo)致包埋的酵母細(xì)胞少。海藻酸鈉濃度低，導(dǎo)致海藻酸鈣凝膠結(jié)構(gòu)中的間隙偏大，從而有一部分酵母細(xì)胞從間隙中漏出，所以包埋的酵母細(xì)胞少。

（2） 海藻酸鈉濃度過高會(huì)導(dǎo)致凝膠珠不成圓形或橢圓形。海藻酸鈉濃度過高時(shí)，在凝膠的表面迅速形成致密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，阻礙了Ca2+向凝膠內(nèi)部的擴(kuò)散，使得凝膠內(nèi)部不能形成完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以凝膠珠的形狀并不是固定的圓形或橢圓形，而會(huì)隨凝膠珠空間位置的變化而發(fā)生變化。

（3） 凝膠珠需要在CaCl2中浸泡30 min。在凝膠珠的形成過程中，先是表面形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，然后Ca2+向凝膠內(nèi)部擴(kuò)散，逐層形交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Ca2+向凝膠內(nèi)部擴(kuò)散是一個(gè)漸近的過程，需要一段時(shí)間。

（4） 檢測拉伸強(qiáng)度是檢測凝膠珠制作是否成功的方法之一。凝膠珠內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)確保凝膠珠具有較好的拉伸強(qiáng)度。將制作好的凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，若有一定彈性不容易破裂（或?qū)⒛z珠在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打，凝膠珠很容易彈起），則說明凝膠珠的拉伸強(qiáng)度較好，表明制備的凝膠珠是成功的。

（5） 用手?jǐn)D壓凝膠珠是否有液體流出是檢測凝膠珠制作是否成功的方法之二。當(dāng)海藻酸鈉滴入氯化鈣溶液中，液滴表面立即膠凝，然后Ca2+向凝膠內(nèi)部擴(kuò)散，膠凝內(nèi)部逐層發(fā)生凝膠反應(yīng)，凝膠珠收縮變小，凝膠中的液體被擠出而進(jìn)入外部介質(zhì)。如果擠壓凝膠珠有液體流出，則說明凝膠內(nèi)部并沒有形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蓄含液體，制作不成功。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 許加超．氯化鈣體系制備的海藻酸鈣凝膠特性的研究［J］．漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2010(1)：100-103.

［2］ 馬萍．海藻酸鈣凝膠微球的制備和pH依賴性溶脹［J］．中國海洋藥物，2003(5)：35-38.