酸性礦排水中微生物遺傳多態(tài)性研究

石磊

氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是一種革蘭氏陰性菌,具有化能自養(yǎng)、好氣、嗜酸、適于中溫環(huán)境等特性,廣泛存在于酸性礦山水及含鐵或硫的酸性環(huán)境中。

1氧化亞鐵硫桿菌的生理特性

氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans):是生物濕法冶金過(guò)程主要的浸礦菌種。這種菌系短桿菌,很小,0.3～0.5×1.0-2.0um,圓鈍末端,以單個(gè)、雙個(gè)或幾個(gè)成短鏈狀存在。是一種化能自養(yǎng)菌,專性好氧,嗜酸性,廣泛生活在金屬硫化礦和煤礦的酸性礦坑水中。最適生長(zhǎng)溫度25℃～30℃。生長(zhǎng)在pH1.4～6.0之間,最適pH2.0～2.5。T.f以氧化亞鐵、元素硫以及還原態(tài)的硫化合物等來(lái)獲得生命過(guò)程所需的能量,以空氣中的二氧化碳為碳源,以氨或銨鹽為氮源。有鞭毛,能快速游動(dòng),革蘭氏染色陰性。在9K固體培養(yǎng)基上呈紅棕色菌落,近桿形[5]。

2氧化亞鐵硫桿菌的氧化機(jī)理

自20世紀(jì)60年代以來(lái),因?yàn)樗鼈兙哂刑厥獾纳飳W(xué)功能,吸引了許多學(xué)者對(duì)T.f和T.t的生理特性進(jìn)行了研究。許多研究表明,T.t利用單質(zhì)硫的能力比T.f強(qiáng),但T.t不能利用硫酸亞鐵。Wong和Henry對(duì)氧化硫酸亞鐵的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的研究,指出能將亞鐵氧化成三價(jià)鐵,三價(jià)鐵會(huì)與硫酸根離子發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生鐵礬沉淀,同時(shí)產(chǎn)生硫酸而引起pH的下降:

4FeSO4+02+2H2SO4→2Fe2(SO4)3+2H2O

(1)

6Fe3++4SO42-+12H2O→2HFe3(SO4)2(OH)6 +10H+(2)

Templellvl和Leathen等人研究發(fā)現(xiàn)氧化亞鐵硫桿菌能將礦物中的硫化礦物氧化為硫酸和硫酸鹽。Bryne等對(duì)T.f氧化硫化礦物的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究。并提出了一些常見礦物的主要反應(yīng)機(jī)理,如黃鐵礦和黃銅礦:

2FeS2+702+2H20→2FeSO4+2H2SO4

(3)

4FeSO4+02+2H2SO4→2Fe2(SO4)3+2H20

(4)

CuFeS2+402→CuS04+FeSO4 (5)

2Cu2S+02+2H2 SO4→2CuS+2CuSO4+2H20

(6)

CuS+202→CuS04(7)

3微生物分子生態(tài)學(xué)研究的一般方法和原理

微生物分子生態(tài)學(xué)是分子生態(tài)學(xué)的重要組成部分,是分子生物學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、微生物生理學(xué)與遺傳學(xué)相互結(jié)合而產(chǎn)生的一門邊緣學(xué)科。從目前的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看,當(dāng)前的主要研究領(lǐng)域有:采用分子生物學(xué)技術(shù)研究不同自然環(huán)境中微生物的種類組成和群落結(jié)構(gòu)以及它們的數(shù)量動(dòng)態(tài)；環(huán)境因子對(duì)微生物基因表達(dá)的影響:自然條件下微生物之間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移:微生物與高等生物相互作用的分子機(jī)制,包括共生關(guān)系的建立、病原微生物的致病機(jī)制等。因此,微生物分子生態(tài)學(xué)是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論與技術(shù),在分子水平上,研究微生物與其生態(tài)環(huán)境間相互關(guān)系的一門新興學(xué)科。

3.1 一般研究方法

(1)平板涂布分離。

(2)顯微鏡觀察:普通光鏡、相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡。

(3)MPN法,即最大或然值計(jì)數(shù)法,是平板涂布分離法的一種,但由于廣泛應(yīng)用,被單獨(dú)作為微生物研究的一種技術(shù)。

(4)活菌計(jì)數(shù)法,常見的用啞嚨橙染色,活菌死菌顏色不一樣。

3.2 分子研究方法

(1)純種分離,G+C測(cè)定、16SrDNA, ISR測(cè)序、比對(duì)。

(2)變性梯度凝膠電泳(DGGE),通用引物PCR擴(kuò)增同樣長(zhǎng)度的基因,常為16S的一段(300bp～400bp),割膠純化、克隆測(cè)序,比對(duì)變性梯度凝膠電泳((DGGE)技術(shù)以土壤微生物群體的基因組DNA為研究對(duì)象,通過(guò)比較不同土壤中各種微生物的16SrRNA基因信息來(lái)了解微生物的多樣性。

(3)FISH熒光原位雜交,設(shè)計(jì)不同熒光染料標(biāo)記的特異探針,檢測(cè)不同分類界元水平的細(xì)菌,可在細(xì)胞水平或者核酸水平與目標(biāo)菌種雜交,在表面熒光顯微鏡或者CLSM(共聚焦激光掃描顯微鏡)下監(jiān)測(cè)。

(4)TRFLP,末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性。

(5)ARDREA.RISA。

(6)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

(7)Real-time實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)技術(shù)。

(8)克隆轉(zhuǎn)化法:通用引物擴(kuò)增從水樣、土樣中提取得總DNA,獲得全長(zhǎng)的16S rDNA序列,隨機(jī)克隆入載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,挑取陽(yáng)性菌落,用不同的限制酶酶切檢測(cè)不同的克隆,測(cè)序、比對(duì)。

(9)DNA芯片技術(shù),主要用來(lái)研究微生物的功能基因組學(xué)。

4本論文的立論依據(jù)

AMD的pH通常很低,嚴(yán)重的地方可達(dá)pH2.0,富含SO42-離子和Fe3+離子,易浸出廢礦石中的有毒元素,如鉛、砷、鉻、銅等以及氰化物,對(duì)礦業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害,所以就AMD的研究越來(lái)越重要。我國(guó)自1959年以來(lái),對(duì)微生物處理污水的技術(shù)的研究已取得了一定的成果,但重點(diǎn)放在污水菌種的保藏的研究方面,而且就整體情況而言與國(guó)外相比要差的遠(yuǎn),在污水處理微生物生物學(xué)方面的研究相對(duì)于前者明顯滯后。不僅設(shè)備、工藝落后,更主要的是對(duì)微生物本身沒有作進(jìn)一步的研究,缺乏對(duì)菌種生物學(xué)性狀較為全面的認(rèn)識(shí),譬如菌種的生理、生化性狀以及分類地位的了解,缺乏對(duì)菌種分子水平上的認(rèn)識(shí)及其在污水處理過(guò)程中菌種所參與的機(jī)理等的研究,因而也就不能很好的指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。從目前發(fā)表的一些較為零碎的文獻(xiàn)及幾本專著看出,在酸性污水中細(xì)菌的研究方面,生物領(lǐng)域的科技工作非常薄弱,主要是一些污水治理方面的專業(yè)人員在從事相關(guān)研究。

目前,我國(guó)對(duì)浸礦細(xì)菌的資源開發(fā)工作做的遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,用于處理酸性污水的細(xì)菌有氧化硫硫桿菌(A.Thiooxidans)和氧化亞鐵硫桿菌((Acidithiobacillus ferrooxidans);鉤端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高溫菌,如文獻(xiàn)報(bào)道的硫化桿菌屬(Sulfobacillus),如熱氧化硫化桿菌(Sulfobacillus thermosuidooxidan)以及一些未確定分類位置的細(xì)菌、嗜酸嗜高溫古細(xì)菌等。就細(xì)菌遺傳多樣性、系統(tǒng)學(xué)研究工作來(lái)說(shuō),目前國(guó)內(nèi)發(fā)表的文獻(xiàn)主要集中在放線菌、根瘤菌、嗜鹽堿的古菌方面,對(duì)硫桿菌其他浸礦細(xì)菌的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育工作而言,國(guó)內(nèi)尚見較為系統(tǒng)的報(bào)道。因此,對(duì)硫桿菌及其它浸礦細(xì)菌的多樣性研究就很有必要。

(1)硫桿菌(Thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系統(tǒng)學(xué)研究目標(biāo)及意義。

在地球表面廣泛分布有元素硫及其金屬化合物而形成的許多特殊環(huán)境,如硫鐵礦、地表及海底的含硫熱泉等。近年來(lái),由于各國(guó)微生物學(xué)家對(duì)極端環(huán)境條件中的微生物資源的研究開發(fā)成為一個(gè)熱點(diǎn),使得硫鐵礦、含硫熱泉等酸性條件中的微生物多樣性的研究取得了較快的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)了許多生理生化性狀特殊的細(xì)菌,其中有些歸屬于硫桿菌,有些目前還未確定其系統(tǒng)位置。分子生物學(xué)技術(shù)在含硫的酸性環(huán)境微生物系統(tǒng)學(xué)、生態(tài)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用,不僅發(fā)現(xiàn)了許多常規(guī)技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)的新細(xì)菌,也對(duì)這些細(xì)菌的分類及系統(tǒng)學(xué)地位的確定提供了有力的手段,同時(shí)對(duì)一些已知細(xì)菌的分類及系統(tǒng)位置進(jìn)行了修訂,使得傳統(tǒng)意義上的硫桿菌分類更趨合理,盡量可以建立一個(gè)亞利士多德所謂的接近于自然的分類體系。對(duì)氧化亞鐵硫桿菌系統(tǒng)學(xué)地位的確定不僅具有重要的理論意義,對(duì)指導(dǎo)細(xì)菌浸礦等生產(chǎn)實(shí)踐中優(yōu)良菌株的選擇也具有直接的應(yīng)用價(jià)值。我國(guó)地域廣闊,各種含硫的礦產(chǎn)資源及自然生態(tài)環(huán)境非常多樣化,蘊(yùn)含著非常豐富的代謝硫的細(xì)菌資源,而倍受國(guó)外微生物學(xué)家的關(guān)注,因此加大這些細(xì)菌資源的開發(fā)和研究力度,將為這些細(xì)菌的生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。本課題研究的目標(biāo)之一就是大量開發(fā)我國(guó)不同酸礦環(huán)境中的微生物資源,尤其是一些硫氧化細(xì)菌及其這些細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)的研究。

(2)不同環(huán)境中嗜酸菌的遺傳多樣性研究及其意義。

由于Acidithiobacillusferrooxidans,A.thiooxidans,A.caldus, Leptospirillumferroo xidans這幾種細(xì)菌能夠氧化亞鐵、還原性的金屬硫化礦,目前被廣泛應(yīng)用于微生物濕法冶金、煤和天然氣脫硫、酸性礦區(qū)的生態(tài)恢復(fù)治理、污水處理等技術(shù),使得這些細(xì)菌成為微生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。但是由于硫礦的化學(xué)組成不同與含硫酸性環(huán)境在地球上的生態(tài)分布與多樣性極其復(fù)雜,使得這類細(xì)菌同一種不同菌株的生理生化性狀表現(xiàn)出顯著的不同,形成了表型差異明顯不同的菌株,同時(shí)造成這些細(xì)菌不同菌株的遺傳組成差異顯著,即所謂的遺傳多樣性,利用分子生物學(xué)技術(shù)研究這些細(xì)菌的遺傳差異,不僅有助于篩選、鑒定出性狀明顯不同、在浸礦實(shí)踐中針對(duì)不同化學(xué)組成的礦體表現(xiàn)高效的菌株,反過(guò)來(lái)也可以從物種進(jìn)化上闡明不同環(huán)境造成的選擇壓對(duì)細(xì)菌進(jìn)化的作用以及細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性,進(jìn)一步對(duì)表型差異懸殊、介于相似種之間的菌株的系統(tǒng)學(xué)地位重新進(jìn)行研究修訂,并且有助于闡明自然界廣泛分布的許多代謝硫、鐵有關(guān)的細(xì)菌的起源及進(jìn)化關(guān)系。目前,雖然微生物冶金基礎(chǔ)研究被列為國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展計(jì)劃,但我國(guó)在浸礦細(xì)菌的生物學(xué)基礎(chǔ)研究方面所作的工作幾為空白,對(duì)這些細(xì)菌的多樣性有待進(jìn)一步研究挖掘。從世界各地大量采集分離純化菌株,進(jìn)一步闡明這些細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)及進(jìn)化關(guān)系,從遺傳多樣性的角度選擇優(yōu)良菌株,為應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

由于我國(guó)生態(tài)環(huán)境多樣性非常豐富,存在各種各樣的富含金屬及硫化合物的生態(tài)環(huán)境,因此有可能分離到生理及遺傳差異明顯的不同菌種,存在非常豐富的種以上水平和種下水平的多樣性。但到目前為止,國(guó)內(nèi)對(duì)嗜酸細(xì)菌物種多樣性和遺傳多樣性的研究幾乎為空白,基于此這兩個(gè)細(xì)菌多樣性的研究是本課題的主要目標(biāo)之一。

5前景展望

在研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行微生物優(yōu)勢(shì)群落的生理生化分析和限制多態(tài)性分析,可繼續(xù)進(jìn)行礦區(qū)酸性污水微生物類群多樣性的研究,進(jìn)而研究礦區(qū)酸性污水微生物類群的結(jié)構(gòu)和分布的特異性,進(jìn)而確定這些菌株分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。由于條件有限,本研究許多方法、步驟還有待改進(jìn)和完善(比如在提取污泥中細(xì)菌的方法上我們有待改進(jìn)),在未分離和測(cè)序的種群中,還蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源,需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。隨著工業(yè)污水微生物資源研究理論的發(fā)展和研究技術(shù)的完善,人們必定從工業(yè)污水微生物中獲得矚目成果,更好地為人們的生產(chǎn)生活服務(wù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 布坎南R E,吉本斯 N E(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所譯).伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第8版)[M].北京:北京科學(xué)出版社,1981:636～637.

[2] Zheng SM (鄭士民),Yan WM (顏望明).Autotrophic Bacterium.Beijing (北京):Beijing Science Press(北京科學(xué)出版社),1983:56～60.

[3] 林建群,顏望明,林建強(qiáng),等.硫桿菌的分子遺傳學(xué)研究[J].微生物學(xué)雜志,2000,3,20(1).

[4] 李龍海,繆應(yīng)祺.酸性礦山水生化處理及資源化的探索[J].江蘇理工大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19(2):69～73.

[5] 張?jiān)诤?王淀佐,胡岳華.氧化亞鐵硫桿菌遺傳選育方法探討[J].濕法冶金,1999,4:28～31.