枯草芽孢桿菌D－29拮抗作用及其抗菌蛋白特性研究

談靜惠，高瑩，程超，李宏，王美琴，郝曉娟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為應(yīng)用較廣的生防微生物，具有與環(huán)境兼容性好、抗菌活性高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［1］?？莶菅挎邨U菌制劑的穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性方面均優(yōu)于不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和真菌生防菌株。其生防作用和生防機(jī)理一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2～7］。研究表明，該菌的生防機(jī)理包括競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗性等，尤以拮抗作用為最主要的防病機(jī)理［8］。

枯草芽孢桿菌D－29菌株是本課題組從地膚中獲得的一株具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌［9］，本研究對(duì)該菌株的抑菌譜和抑菌物質(zhì)特性進(jìn)行了分析，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌D－29菌株和棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.melongenae）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、梨樹腐爛病菌（Valsa mali）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp niveum）、玉米穗腐病菌（Fusarium graminearum）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等菌株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。供試真菌菌株的培養(yǎng)及平板對(duì)峙試驗(yàn)使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），內(nèi)生細(xì)菌D－29的培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）［10］。

1.2 D－29對(duì)供試病原菌的拮抗作用

平板對(duì)峙法［11］測(cè)定D－29對(duì)供試病原真菌拮抗作用。

抑制率／%＝［（對(duì)照真菌菌落直徑－處理真菌菌落直徑）／（對(duì)照真菌菌落直徑－6）］×100%。

菌落直徑＝（水平直徑＋垂直直徑）／2

1.3 D－29菌株抑菌蛋白提取與抑菌活性測(cè)定

將斜面活化的枯草芽孢桿菌D－29菌株接種到裝有150mL NB培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，在170r·min－1，28 ℃培養(yǎng)48h。4 ℃，10000r·min－1離心10min，收集上清液。用不同飽和度的硫酸銨分級(jí)鹽析，4℃下沉淀12h后，4℃、10000r·min－1離心10min，取上清備用，沉淀用少量體積20mmol·L－1的 Tris－Hcl緩沖液（pH 6.8）溶解，用同種緩沖液透析去鹽即得到抑菌蛋白粗提液。平板擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性［12］。

1.4 D－29蛋白粗提液的穩(wěn)定性測(cè)定［13］

熱穩(wěn)定性：將蛋白粗提液分別在50℃處理60 min、80℃ 處理30min和60min、100℃處理30 min和60min。

pH穩(wěn)定性：將蛋白粗提液用鹽酸和氫氧化鈉分別 調(diào) 至 pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，4 ℃靜置過夜，用鹽酸和氫氧化鈉將各pH值調(diào)回中性后檢測(cè)活性。

對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性：在蛋白粗提液中分別加入等體積的乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮和甲醇，充分混勻，30min后，熱水?。s50℃）去除有機(jī)溶劑檢測(cè)活性。

紫外照射穩(wěn)定性：將蛋白粗提液在20W紫外燈下距離10cm 分別照射0、2、4、6、8、10、12h后檢測(cè)活性。

平板擴(kuò)散法測(cè)定活性，每孔加處理過的蛋白粗提液40μL，以未處理的粗蛋白作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 D－29對(duì)供試病原菌的拮抗作用測(cè)定結(jié)果

由表1可以看出，D－29對(duì)11種供試病原菌均有抑制作用，具有廣譜抑菌活性。D－29對(duì)西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌率分別為31.6%和31.3%；對(duì)玉米大斑病菌拮抗作用最強(qiáng)烈，抑菌率高達(dá)54.6%。

表1 枯草芽孢桿菌D－29對(duì)病原菌的拮抗作用Table 1 Antagonistic effects of Bacillus subtilis D－29on pathogens

2.2 D－29蛋白粗提液活性測(cè)定結(jié)果

由圖1可以看出，隨著硫酸銨飽和濃度的增大，有效物質(zhì)的沉淀量逐步增大，拮抗活性隨之上升，而上清液對(duì)玉米大斑病菌的抑制作用成逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到80%時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，上清液拮抗活性最低（圖2）。確定抑菌蛋白最佳鹽析飽和度為80%。

圖1 不同飽和度硫酸銨沉淀抗菌蛋白抑菌活性Fig.1 Effects of different saturation of ammonium sulfate on inhibiting activity of antifungal protein

2.3 D－29蛋白粗提液的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 熱穩(wěn)定性

蛋白粗提液50℃處理60min后，活性與對(duì)照相比沒有變化，100℃60min后，仍保持了66%的抑菌活性（圖3）。結(jié)果表明D－29蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖2 硫酸銨沉淀抗菌蛋白抑菌活性Fig.2 Effect of ammonium sulfate on inhibiting activity of antifungal protein注：1：80%沉淀2：80%上清3：D－29無菌濾液4：NANote：1：80%precipitation 2：80%supernatant 3：germfree filtrate 4：NA

圖3 溫度對(duì)蛋白粗提液的活性影響Fig.3 Effect of temperature on on inhibiting activity of crude protein

2.3.2 pH 穩(wěn)定性

蛋白粗提液在pH 2.0～9.0范圍內(nèi)活性較穩(wěn)定，在pH 5.0～7.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.9cm。當(dāng)pH大于9.0時(shí)蛋白活性急劇下降。粗提蛋白在強(qiáng)酸條件下穩(wěn)定，但在強(qiáng)堿條件下抑菌活性不穩(wěn)定 （圖4）。

圖4 pH蛋白粗提液的影響Fig.4 Effect of pH on on inhibiting activity of crude protein

2.3.3 對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性

蛋白粗提液經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，乙醚處理抑菌活性不變，其它處理對(duì)抑菌活性略有影響，受影響最大的為丙酮處理，其抑菌活性為對(duì)照的86.2%（圖5）。該蛋白粗提液對(duì)供試有機(jī)溶劑均具有一定的穩(wěn)定性。

圖5 有機(jī)溶劑對(duì)菌株D－29蛋白粗提液的影響Fig.5 Effect of organic solvent on on inhibiting activity of crude protein

2.3.4 紫外照射穩(wěn)定性

蛋白粗提液經(jīng)不同時(shí)間的紫外照射后，抑菌活性沒有變化。結(jié)果表明該蛋白在紫外照射下具有穩(wěn)定性。

3 討論

枯草芽孢桿菌是一種嗜溫的好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌，具有廣泛的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，易于商業(yè)化，因此一直是植病生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐［14］?？莶菅挎邨U菌能夠分泌多種抗菌蛋白抑制植物病原真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖［15，16］。

隨著對(duì)植物病害生物防治要求的提高。人們?cè)絹碓蕉嗟陌炎⒁饬ν度氲揭志镔|(zhì)的研究上。本研究中D－29對(duì)番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌等11種病原菌均有不同程度的抑制作用，具有廣譜抑菌活性。其中對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果最好，抑菌率高達(dá)54.6%，形成最佳的病害菌株組合。獲得的蛋白粗提液耐高溫、耐強(qiáng)酸、對(duì)有機(jī)溶劑、光照不敏感，有利于生防產(chǎn)品的開發(fā)。通過對(duì)菌株D－29抑菌蛋白的蛋白的理化性質(zhì)研究，為蛋白的分離純化及揭示該菌生防機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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