黃芩素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及對(duì)腎組織中TGF-β1和Smad-2表達(dá)的影響

王文玉，郭 孜，孫淑軍，戴建業(yè)，曹慧娟，鄭寧寧，房軍偉，茍小軍，陸 雄，張永煜*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病所，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心 光鏡室，上海 201203)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血安胎等功效。已有研究[1-3]報(bào)道，黃芩及黃芩提取物具有抗肝、肺纖維化的作用，黃芩總苷元提取物對(duì)于氯化汞所致大鼠腎纖維化也具有一定改善作用[4]。目前臨床上尚無專門治療腎纖維化的藥物,而研究表明黃芩及其提取物有一定抗纖維化的作用。本研究主要觀察黃芩素對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)所致大鼠腎纖維化的干預(yù)作用，并利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)腎組織中TGF-β1和Smad-2表達(dá)的影響進(jìn)行研究，以期尋找一種治療腎纖維化的有效物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 黃芩素(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，98%)，科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)，羥脯氨酸試劑盒，單克隆小鼠TGF-β1抗體，多克隆兔Smad-2抗體，SABC試劑盒(SA1022，兔IgG-KIT)，SABC試劑盒(SA1021，小鼠IgG-1/2KIT)，DAB顯色試劑盒，蘇木素染液，磷酸鹽PBS緩沖液(pH 7.4～7.6)，檸檬酸鹽緩沖液，中性樹膠，二甲苯。

1.2 動(dòng)物及分組 SD雄性大鼠，體質(zhì)量(160±10)g,由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組8只：假手術(shù)組、模型組、科素亞(陽性藥)治療組20 mg/(kg·d)、黃芩素高劑量組200 mg/(kg·d)、黃芩素低劑量組100 mg/(kg·d)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模及處理 除假手術(shù)組外,其他4組行單側(cè)輸尿管結(jié)扎。手術(shù)當(dāng)天給藥，分別灌胃10 d,假手術(shù)組和模型組以等容積的0.5%CMC-Na代替。處死大鼠前1 d收集24 h尿液并記錄尿量。大鼠腹腔注射麻醉后仰臥位固定，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清。摘取左側(cè)腎臟，留取部分用10%福爾馬林固定，部分用于羥脯氨酸含量測(cè)定。

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 將所分離的血清及尿液各取100 μL,分別按各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)說明書的操作方法，測(cè)定血清Scr，BUN，尿液Cr，腎臟組織Hyp含量，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率。

2.3 組織病理學(xué)觀察 將10%福爾馬林固定后的腎臟組織石蠟包埋,行HE和天狼星紅染色，光鏡觀察其病理改變。

2.4 免疫組化觀察腎組織TGF-β1、Smad-2表達(dá) 采用SABC法,按試劑盒說明進(jìn)行操作。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠腎功能的影響 見表1。

3.2 對(duì)大鼠腎組織Hyp含量的影響 見表2。

表1 對(duì)大鼠腎功能Scr、BUN、內(nèi)生肌酐清除率的影響(±s)

表2 對(duì)大鼠腎組織Hyp含量的影響(±s)

3.3 組織病理學(xué)觀察 見圖1，圖2。

HE染色見圖1，假手術(shù)組結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)無改變，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，小管與小管之間間隙緊密，小管間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落壞死、部分腎小管明顯萎縮、部分腎小管明顯擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；科素亞組見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維組織增生，腎小管輕度擴(kuò)張，部分腎小球輕度萎縮，腎小囊擴(kuò)張，但還保留著一部分正常的小管和小球結(jié)構(gòu)；黃芩素治療組腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)損傷輕于同期模型組。

天狼星紅染色見圖2,假手術(shù)組可見腎小管間質(zhì)染色較少；模型組可見腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)明顯增寬，膠原大量沉積，尤以髓質(zhì)明顯；科素亞組、黃芩素治療組較模型組，腎纖維化程度明顯降低。

3.4 對(duì)各組大鼠腎組織中TGF-β1和Smad-2表達(dá)的影響 見表3。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1和Smad-2含量的比較(±s)

4 討論

腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同病理途徑。臨床上，輸尿管梗阻是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化最終至腎衰竭的常見原因之一。

本實(shí)驗(yàn)研究中，在手術(shù)后第10天，模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟顯著增大腫脹，嚴(yán)重出現(xiàn)積水，包膜顯著增厚，科素亞治療組較模型組大鼠腫脹及積水情況減輕，且包膜較薄，黃芩素治療組梗阻側(cè)腎臟腫大及積水程度較輕，色澤較紅潤(rùn)，說明各治療組均可以改善梗阻側(cè)腎臟積水及腫脹程度。在UUO造模第10天時(shí),模型組大鼠血肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)和腎組織羥脯氨酸含量(Hyp)均高于假手術(shù)組，內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)明顯低于假手術(shù)組，提示已造成腎臟損傷。光鏡下觀察到模型組已出現(xiàn)纖維化，而各給藥組對(duì)纖維化有改善作用。

綜上所述，黃芩素可明顯改善梗阻側(cè)腎臟的腫脹及積水情況，在生化指標(biāo)方面可改善大鼠血清腎功能，在病理形態(tài)學(xué)方面可明顯減輕腎小管間質(zhì)的損傷程度、間質(zhì)纖維化程度及淋巴單核細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。近年的研究發(fā)現(xiàn)，腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過程由多種因素參與，涉及多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)等。TGF-β1是腎纖維化的關(guān)鍵因素,Smad蛋白是TGF-β家族信號(hào)從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-6]。通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，黃芩素可顯著降低腎組織中TGF-β1和Smad-2的蛋白表達(dá)，表明黃芩素可能通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮抗腎纖維化作用。

總之，黃芩素可改善腎臟損傷，對(duì)腎臟有一定保護(hù)作用，但不能完全逆轉(zhuǎn)腎纖維化狀態(tài)。

A假手術(shù)組 B模型組 C科素亞組 D黃芩素高劑量組 E黃芩素低劑量組

A假手術(shù)組 B模型組 C科素亞組 D黃芩素高劑量組 E黃芩素低劑量組

[1]Nan J-x,Park E J,YC K,et al.Scutellaria baicalensis inhibits liver fibrosis induced by bile duct ligation or Carbon tetrachloride in rats[J].J Pharm Phamlacol,2002,54(4):555-563.

[2]Inoue T,Jackson E K.Strong antiproliferative effects of baicalein in cultured rat hepatic stellate cells[J].European Journal of Pharmacology,1999,378(1):129-135.

[3]盛麗,姚嵐,王莉,等.沙參水蛭黃芩人參對(duì)博萊霉素小鼠肺纖維化的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24(6)：1000-1002.

[4]謝紅東,楊珂,穆煥德,等.黃芩提取物對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及其抗氧化機(jī)制[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2009,10(3):240-242.

[5]Pirk E,Heldin C H,Ten-Dijke T P,et al.And regulation in TGF-β superfamily signaling[J].FASED Journal,1999,13(15):2105-2124.

[6]Sshiffer M,Von Gersdorff G,Bitzer M,et al.Smad proteins and transforming growth factor-beta signaling[J].Kidney International.Supplement,2000,77(77):45-52.