基于蛋白A－納米金－絲網(wǎng)印刷電極的雌二醇免疫傳感器*

楊 勇，牟婧男，丁亞萍，王俊霞，李健爽，杜曉燕*，常 東

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，哈爾濱150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150001)

環(huán)境雌激素EEs(Environmental Estrogens)可通過污水、食品、藥品等進(jìn)入到機體當(dāng)中［1］，進(jìn)而危害機體的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，并且可對腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生影響［2－3］。在各種環(huán)境雌激素中，甾類雌激素的危害較大［4］。雌二醇是一種甾類雌激素，有α、β兩種構(gòu)型，其中17β－雌二醇生物活性最強。目前報道的雌二醇測定方法有高效液相色譜法［5］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［6］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［7］及各種免疫分析法［8－9］等?；诿庖叻磻?yīng)的電化學(xué)傳感器，分析時間短、操作簡便且靈敏度較高，利于實現(xiàn)對樣品的實時、現(xiàn)場、在線測定。相比放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫法(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)等免疫測定方法，電化學(xué)免疫傳感器是將抗體固定到電極表面，方便與未反應(yīng)的雌二醇抗原分離，每次測定僅消耗幾微升的試劑和樣品，因此免疫傳感器在測定激素類物質(zhì)中具有很好的應(yīng)用前景［10］。

蛋白A對抗體具有定向固定作用，能使抗體上與抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的活性片段一致朝外［11］，避免了固定抗體取向的雜亂無章，可提高抗體的利用效率，并且蛋白A可避免抗體直接接觸金屬而失活。本研究選擇一次性絲網(wǎng)印刷電極作為基礎(chǔ)電極，印刷電極制作簡單方便、成本低、重復(fù)性好，最重要的是印刷電極可實現(xiàn)快速平行測定，更利于實際應(yīng)用和商品化［12］。應(yīng)用電化學(xué)法將納米金沉積在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通過改變實驗參數(shù)有效地控制了納米顆粒的大小和密度。在納米金上固定蛋白A，通過蛋白A分子定向固定抗17β－雌二醇抗體。利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的雌二醇和樣品中的雌二醇與固定化抗體發(fā)生酶免疫競爭反應(yīng)，測定樣品中17β－雌二醇含量。實驗結(jié)果表明以蛋白A為載體固定抗體后能夠很大地提高免疫反應(yīng)的檢測靈敏度，且辣根過氧化物酶對硫堇－過氧化氫體系有很好的催化作用，酶底物產(chǎn)生靈敏的電流信號。尿液中雌二醇含量可反映機體對環(huán)境雌激素的接觸量，在臨床上測定內(nèi)源性雌激素有一定的意義，所以選擇人體尿液作為測定對象，研究表明該免疫傳感器對人尿液中雌二醇的測定結(jié)果較好。

1 實驗部分

1.1 儀器

CHI660A電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);掃描電子顯微鏡－QUANTA200F(美國FEI公司);超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠);高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);絲網(wǎng)印刷電極(南京天鼎生物技術(shù)研究所)。

1.2 試劑

蛋白A(美國IL公司);硫堇(英國Alfa Aesar公司);氯金酸(美國Acros Organics公司);17β－雌二醇(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的17β－雌二醇(天津天健生物制藥公司);磷酸鹽緩沖片(PBS，pH7.4)、兔抗17β－雌二醇抗體、牛血清白蛋白(BSA)均來自美國Sigma公司;甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純;實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫電極的制備

實驗中的電極如圖1，工作電極:直徑2.5 mm，銀底碳電極;對電極:銀底碳電極;參比電極:銀－氯化銀電極。取同一批次的電極用無水乙醇和去離子水各超聲清洗5 min，然后在0.1 g/L氯金酸溶液中用恒電位法(－0.2 V)沉積60 s，沉積前先向氯金酸溶液中通入高純氮氣20 min以除氧，沉積后用去離子水清洗表面，用高純氮氣吹干。

圖1 絲網(wǎng)印刷電極的組成

取5 μL濃度為1 g/L蛋白A溶液滴加到工作電極表面，4℃冰箱中過夜，然后反復(fù)清洗表面，室溫干燥。取5 μL濃度為0.1 g/L兔抗17β－雌二醇抗體溶液滴加到工作電極上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1 h，PBS清洗后用1%的BSA在4℃冰箱中封閉2 h，反復(fù)清洗，最后在工作電極表面滴一滴pH7.4的PBS，放入4℃冰箱備用(每一步反應(yīng)結(jié)束后都用pH 7.4的PBS反復(fù)清洗以除掉未結(jié)合的試劑)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的測定

用10%的甲醇將17β－雌二醇配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取4 μL標(biāo)準(zhǔn)液和4 μL酶標(biāo)17β－雌二醇(稀釋倍數(shù)為1∶100)滴加到免疫電極的工作電極上，用微量加樣器在電極表面輕輕混合3次，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min，用PBS反復(fù)清洗后在1 mmol/L 的硫堇［13］+0.03%H2O2溶液(pH5.5乙酸鹽緩沖液配制)中用循環(huán)伏安法測定還原峰電流值，峰電流與雌二醇含量呈負(fù)相關(guān)。

1.3.3 尿中17β－雌二醇的測定

分別收集正常男性和女性尿樣各10例測定。尿中的17β－雌二醇主要以結(jié)合態(tài)的形式存在，為了不影響免疫反應(yīng)，首先要對其進(jìn)行解離。采用酸水解法［14］，取0.5 mL尿樣于4 mL具塞離心管中，加入0.05 mL濃鹽酸和0.5 mL甲醇，80℃水浴1 h，然后用5 mol/L的NaOH 溶液調(diào) pH 至7.0 ～7.5，用 pH 7.4 的 PBS 稀釋到4 mL，此時尿樣稀釋8倍，10 000 rot/min高速離心10 min后，取上清液檢測，測定步驟按照2.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾納米金條件的優(yōu)化及表征

電極在0.1 g/L氯金酸溶液中，經(jīng)不同時間沉積后，測定硫堇－過氧化氫體系的還原峰電流值。隨著沉積時間的增加硫堇－過氧化氫體系的還原電流逐漸增大，當(dāng)沉積時間增加到60 s以后峰電流變化不大，結(jié)果見圖2。對沉積時間為60 s的電極進(jìn)行掃描電鏡表征，結(jié)果如圖3所示，金顆粒的平均粒徑小于30 nm，一致性較好。因此選擇在0.1 g/L氯金酸溶液中－0.2 V電壓下沉積60 s作為沉積條件。

圖2 納米金沉積時間對響應(yīng)信號的影響測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

圖3 沉積時間為60 s的掃描電鏡圖

2.2 修飾電極的循環(huán)伏安法表征

用循環(huán)伏安法表征不同修飾階段的電極，如圖4所示。與裸電極相比，修飾納米金后電極在硫堇－過氧化氫溶液中的響應(yīng)電流增大，這是因為修飾了納米金后電極比表面積增大，有利于電活性物質(zhì)的電化學(xué)反應(yīng)、另外修飾納米金后也加快了電極的電子傳遞。當(dāng)納米金上吸附蛋白A后響應(yīng)電流下降，因為蛋白A大分子阻礙了電子傳遞。當(dāng)?shù)鞍譇上固定抗體后電流再次下降，因為抗體為大分子蛋白質(zhì)進(jìn)一步阻礙電子傳遞?？贵w與酶標(biāo)抗原結(jié)合后電流有較大幅度的增長，是酶催化作用的結(jié)果。

圖4 修飾電極的循環(huán)伏安法表征圖測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.3 蛋白A的作用

比較了未修飾和修飾蛋白A電極的測定信號，如圖5所示。修飾了蛋白A的電極，經(jīng)固定抗體和免疫反應(yīng)后，測定硫堇－過氧化氫體系的還原電流信號明顯增強，而相比之下，未修飾蛋白A的免疫電極測定信號小很多。由此得知蛋白A在電極的修飾過程中起到重要的作用，可增加抗體固定量并介導(dǎo)抗體有序定向修飾，提高抗體利用率;并且避免了抗體直接固定到納米金上易失活、在洗脫過程中易脫落的問題，進(jìn)而提高免疫反應(yīng)的靈敏度，所以對電流響應(yīng)有明顯增強作用。該免疫傳感器與17β－雌二醇在玻碳電極上的直接差分脈沖伏安法測定比較，靈敏度提高約4個數(shù)量級［15］。

圖5 蛋白A對測定信號的影響測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.4 溫育時間對測定的影響

考察了溫育時間對抗原抗體反應(yīng)的的影響，結(jié)果如圖6所示。隨溫育時間的增加，響應(yīng)信號增大，表示免疫反應(yīng)需要足夠的時間才能完成。當(dāng)溫育時間超過30 min后還原峰電流不再增加，說明免疫反應(yīng)已趨于穩(wěn)定，所以選擇30 min作為溫育時間。

圖6 溫育時間對最后測定信號的影響

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化條件下，用修飾好抗體的免疫電極對17β－雌二醇標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)液中17β－雌二醇含量與酶催化的硫堇－過氧化氫體系還原峰電流呈負(fù)相關(guān)，見圖7。17β－雌二醇含量在0.1 μg/L ～20 μg/L范圍內(nèi)與被測信號有良好線性關(guān)系，R2=0.9899，線性回歸方程為 y=3.8508－0.4843lgc(P＜0.05)，檢出限為0.035 μg/L，圖8 顯示不同濃度 17β－雌二醇的實際測定曲線。

圖7 測定17β－雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 循環(huán)伏安法測定不同濃度17β－雌二醇從下到上17β－雌二醇濃度依次為0、0.1 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L

2.6 方法精密度

選用濃度為1 μg/L和10 μg/L兩個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平行測定8次，結(jié)果見表1，響應(yīng)信號的RSD%均小于1%，該方法一致性較好。

表1 方法精密度

2.7 樣品分析

取正常男性和女性(年齡在23歲～28歲)尿樣各10份，測定雌二醇含量，結(jié)果見表2。男性尿樣中17β－雌二醇含量在0～7 μg/L之間，女性由于受排卵周期的影響尿樣中17β－雌二醇含量范圍較寬，在10 μg/L～100 μg/L之間，結(jié)果與用色譜法測定的相關(guān)報道一致［16］。選擇男女各1份尿樣對精密度進(jìn)行考察，結(jié)果如表3，RSD%＜10%，一致性較好。選擇男女各3份尿樣考察回收率，結(jié)果如表4，回收率在96%～114%范圍內(nèi)。在免疫電極表面滴上一滴pH 7.4的PBS，放入4℃冰箱7 d，對同一樣本的測定信號僅下降1%，說明該傳感器穩(wěn)定性較好。

表2 人體尿樣中17β－雌二醇的測定

表3 人體尿樣中17β－雌二醇測定的精密度分析

表4 人體尿樣中17β－雌二醇含量的加標(biāo)回收率測定

3 結(jié)論

本文研究了基于納米金和蛋白A修飾電極的免疫傳感器，對17β－雌二醇的測定顯示了非常高的靈敏度，測定實際樣品結(jié)果較好，有望應(yīng)用于環(huán)境、食品、動物體液中該物質(zhì)的快速測定，對于其它激素類物質(zhì)的測定也有一定借鑒價值。

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