水分管理及雙氰胺對稻田土壤硝化菌亞硝化菌及反硝化菌的影響研究

潘海龍

摘要：用MPN法測定不同水分管理、硝化抑制劑條件下稻田土壤硝化菌、亞硝化菌及反硝化菌的數(shù)量變化。水分含量較高（110％WFPS）時，反硝化細菌含量較高，達到160萬個/g干土；硝化細菌、亞硝化細菌受到抑制，分別只有2.4萬個/g干土、0.49萬個/g干土。水分較低（60％WFPS）時，反硝化細菌含量減少顯著，僅為17萬個/g干土；而硝化細菌、亞硝化細菌迅速增加，分別達到35萬個/g干土、3.5萬個/g干土。雙氰胺對稻田土壤亞硝化菌抑制顯著，高濃度（2%）的雙氰胺對硝化菌也有明顯的抑制作用，而對土壤反硝化菌僅有輕微抑制。

關(guān)鍵詞：硝化菌 亞硝化菌 反硝化菌 雙氰胺

Abstract:The nitrobacteria, nitrosobacteria and denitrifying bacteria population were determinded inpaddy soil under different moisture conditions and nitrification inhibitors by MPN enumeration method.The results of which are 1.6×106 denitrifying bacteria,2.4×104 nitrobacteria and 4.9×103 nitrosobacteria per gram in dry soilunder 110%WFPS and 1.7×105 denitrifying bacteria,3.5×105nitrobacteria and 3.5×104 nitrosobacteria per gram in dry soil under 60%WFPS indicated that the number of denitrifying bacteria was very enormous under110%WFPS,but, nitrobacteria and nitrosobateria was restrained.Denitrifying bacteria reduced repidly under 60%WFPS, whereas ,nitrobacteria and nitrosobateria quickly increased. Dicyandiamide could restrain nitrosobacteria significantly,and nitrobacteriawould also be remarkably restrained under high dicyandiamide concentration,while denitrifying bacteria slightly.

Key words: nitrobacteria，nitrosobacteria，denitrifying bacteria，dicyandiamide

中圖分類號： TQ352 文獻標識碼： A 文章編號：

1.簡介

氧化亞氮（N20）作為大氣的微量氣體成分之一，近年來受到全球性的關(guān)注。這是因為N20除了具有吸收紅外線的性質(zhì)，能減少地表通過大氣向外空的熱輻射，進而導(dǎo)致溫室效應(yīng)外，還表現(xiàn)為在平流層中的N20可與D電離層的氧原子發(fā)生反應(yīng)生成NO，并進一步與同溫層的臭氧（O3）發(fā)生反應(yīng)，從而消耗O3，破壞臭氧層，導(dǎo)致到達地球表面的紫外輻射增強，使人類的生存健康受到影響。因此，N20在大氣中濃度的增加及其排放影響因素倍受關(guān)注。[2-5]

在生物形成N20的過程中，微生物的硝化和反硝化作用被認為是最基本的機理。參與硝化、反硝化過程的微生物類群主要包括：硝化細菌、反硝化細菌等。土壤中N20的產(chǎn)生主要來源于土壤微生物參與下的硝化及反硝化反應(yīng)。各種不同的自然條件大都通過影響微生物的數(shù)量和活性來影響土壤N20的釋放。[6]

土壤含水量很低、長期淹水不利于硝化、反硝化細菌的生長。對稻田土壤來說，土壤水分含水量始終處于較高或很高的狀態(tài)，這時土壤通氣性就有可能成為微生物活性最重要的制約因素。[10]在無降雨或降雨量較少期間，土壤含水量適中，通氣性良好，土壤硝化作用及反硝化作用都能以較高速率進行且以N20為主要產(chǎn)物。當降雨量大時，土壤由于持續(xù)淹水而處于缺氧和強還原狀態(tài)，N20的產(chǎn)生以反硝化為主，但這時反硝化作用產(chǎn)生的N20可N20還原酶還原為N2，加上水層對N20向大氣擴散的及對N20的少量溶解，所以這段期間稻田向大氣排放的N20量很少。

在特定條件下，硝化作用是導(dǎo)致N20、NO生成的主要微生物途徑。亞硝化單胞菌屬在厭氣條件下產(chǎn)生N20，表明硝化作用不是N20的直接來源。通氣土壤，亞硝化單胞菌屬細菌利用NO2-—作為最終電子受體產(chǎn)生N20。缺乏NO3-，微生物可能還原更多的N20。根分泌物通過消耗根際氧，產(chǎn)生厭氣環(huán)境，可刺激反硝化作用。

此外，植物與土壤的相互作用極大的影響著土壤-植物系統(tǒng)中N20的釋放。一方面植物根系及根系分泌物一定程度上改變了土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，促進了土

壤中的微生物過程和N20的產(chǎn)生。[17]研究表明，根的生長不但消耗02、NO3-、NH4+和水，還能改變土壤結(jié)構(gòu)，分泌有機酸改變根系PH，并提供有機碳化物刺激微生物活動。另一方面，植物根系殘落物和分泌物還會導(dǎo)致根際反硝化強度的增加，反硝化微生物的活性與根區(qū)含碳物質(zhì)的濃度密切相關(guān)。[18]水稻根有著明顯的向外泌氧的過程，能夠提高周圍環(huán)境的氧化還原電位，進而影響到硝化細菌、反硝化細菌的增長、繁殖。[19-21]

目前，對于各種處理條件下稻田土壤N20的排放通量變化及影響因子有較詳盡的報道。其中硝化-反硝化作用過程的微生物機理還沒有深入的認識，關(guān)于土壤中N20排放量與微生物菌群和數(shù)量的關(guān)系研究的較少。本實驗初步探討不同水肥條件下稻田土壤中氮循環(huán)細菌菌群的數(shù)量變化，對土壤N20釋放的生物學(xué)機理研究具有重要意義。[22]

2.材料與方法

2.1試供土壤

試驗土壤取自浙江大學(xué)農(nóng)場水稻田，土壤理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)：2.8％，pH值：7.95，采樣后將稻田土壤風干、磨細，過2mm篩備用。

2.2處理與培養(yǎng)

2.2.1處理

實驗分為兩組：低濃度DCD（0.4mg/培養(yǎng)）、高濃度DCD（2mg/培養(yǎng)），每組試驗設(shè)4種不同的水分管理模式：淹水（110％WFPS）、臨界飽和水（95％WFPS）、模擬旱地水分（60％WFPS）以及水旱交替（95－60％WFPS），WFPS表示的是土壤孔隙充水率。每種水分條件設(shè)2種施肥方式：施肥（9.9mg尿素/培養(yǎng)，相當于154mg－N/kg）、不施肥。

2.2.2培養(yǎng)

稱取30g過2mm篩的風干土樣放入250ml有密封蓋的培養(yǎng)器中，在30℃下恒溫培養(yǎng)。雙氰胺與尿素配制成溶液后一起加入。培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)器敞開。干濕交替處理為7天濕（95％WFPS）,7天旱（60％WFPS）交替管理。

2.3采樣與接種

每組培養(yǎng)在預(yù)培養(yǎng)的第5天取樣，水分交替的培養(yǎng)在交替前、后3天采樣接種。其他培養(yǎng)在正式培養(yǎng)的第7天采樣接種。采樣的新鮮土樣制成10-1至10-5的土壤懸浮液，搖勻，分別接種于硝化細菌培養(yǎng)基、亞硝酸氧化細菌培養(yǎng)基和反硝化細菌培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.結(jié)果與討論

3.1 水分條件對硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌的影響

實驗證明，硝化細菌、亞硝化細菌、反硝化細菌的數(shù)量主要決定于土壤水分含量。水分含量較高（110％WFPS）時，稻田土壤中硝化細菌、亞硝化細菌含量很少，分別只有2.4萬個/g干土、0.49萬個/g干土，而反硝化細菌含量卻很高，達到160萬個/g干土。當水分含量較低（60％WFPS）時，情況相反，稻田土壤中硝化細菌、亞硝化細菌含量很高，分別達到35萬個/g干土、3.5萬個/g干土，是水分含量為110％WFPS時硝化細菌量的15倍 、水分含量為110％WFPS時亞硝化細菌的7倍；反硝化細菌僅為17萬個/g干土，只有水分含量為110％WFPS時 的十分之一。由此看出，稻田土壤水分含量的多少與硝化細菌、亞硝化細菌及反硝化細菌的數(shù)量有直接關(guān)系，是決定土壤中硝化細菌、亞硝化細菌及反硝化細菌的數(shù)量變化的主要因素。土壤含水量較高（110％WFPS）時，土壤透氣性降低，處于缺氧狀態(tài)，環(huán)境中氧化還原電位極低，硝化細菌、亞硝化細菌由于缺乏電子受體而受到抑制。同時，由于高水分條件造成的厭氧環(huán)境抑制硝化細菌的NH4+單氧化酶的活性[5]，造成了土壤中硝化細菌、亞硝化細菌的數(shù)量和活性均較低，硝化作用十分微弱。但是，高水分條件造成的厭氧還原狀態(tài)解除了反硝化細菌的氧毒害作用，促進反硝化細菌的生長和繁殖，使得反硝化細菌數(shù)量迅速增加。土壤水分含量低（60％WFPS）時，土壤通透性好，土壤氧化還原電位較高，處于氧化狀態(tài)，硝化細菌、亞硝化細菌數(shù)量迅速增加。高氧化還原電位抑制了反硝化細菌的生長，反硝化細菌數(shù)量含量急劇減少。

從絕對數(shù)量上看，亞硝化細菌在水分適宜（60％WFPS）時最大數(shù)量為3.5萬個/g干土數(shù)量，大大低于硝化細菌和反硝化細菌的數(shù)量。這可能與NO2－在土壤中容易轉(zhuǎn)化、不易積累有關(guān)，由于NO2－的缺乏，使得亞硝化細菌能源供應(yīng)不足，抑制了亞硝化細菌數(shù)量的增加。

3.2 雙氰胺對硝化菌、亞硝化菌和反硝化菌的影響

圖1在不同雙氰胺濃度下稻田土壤硝化細菌數(shù)量的變化

圖2在不同雙氰胺濃度下稻田土壤亞硝化細菌數(shù)量的變化

圖3在不同雙氰胺濃度下稻田土壤反硝化細菌數(shù)量的變化

由實驗數(shù)據(jù)繪圖結(jié)果可看出，低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤硝化細菌影響不明顯，高濃度的雙氰胺（2%）卻能夠明顯抑制硝化細菌的數(shù)量，一般會降低一個數(shù)量級左右。這可能與雙氰胺中的氰基和細菌呼吸酶中的硫氫基或金屬基團的反應(yīng)有關(guān)。低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤亞硝化菌較為明顯，高濃度的雙氰胺（2%）對亞硝化菌的抑制作用十分強烈，在60％WFPS水分條件下，2%雙氰胺能夠使得土壤亞硝化細菌數(shù)量降低達1.5個數(shù)量級。低濃度的雙氰胺（0. 5%）對反硝化菌僅有輕微抑制，高濃度的雙氰胺（2%）使這種抑制作用略有增加。雙氰胺對硝化作用的抑制引起阻斷了NH4＋向NO3－的轉(zhuǎn)化，土壤中的NO3－濃度降低，反硝化作用反應(yīng)底物減少，從而造成了對反硝化細菌的抑制。

4.結(jié)論與展望

結(jié)論：

1.硝化細菌、亞硝化細菌、反硝化細菌主要決定于土壤水分含量。水分含量較高時，土壤處于還原狀態(tài)，反硝化細菌含量較高，硝化細菌、亞硝化細菌受到抑制；水分含量較低時，土壤處于氧化狀態(tài)，反硝化細菌含量減少，硝化細菌、亞硝化細菌迅速增加。硝化細菌、亞硝化細菌、反硝化細菌主要決定于土壤水分含量。水分含量較高時，土壤處于還原狀態(tài)，反硝化細菌含量較高，硝化細菌、亞硝化細菌受到抑制；水分含量較低時，土壤處于氧化狀態(tài)，反硝化細菌含量減少，硝化細菌、亞硝化細菌迅速增加。侯愛新等對水稻田水分含量變化的試驗也表明，土壤含水量較高的淹水期，由于淹水造成的厭氧環(huán)境可以抑制硝化細菌的NH4+單氧化酶的活性，同時，反硝化作用則由于氧化還原電位降至0以下，代謝產(chǎn)物主要以N2為主，幾乎沒有N20的凈排放。而落干期，由于可得性氧氣增多，硝化細菌酶活性抑制被解除，反硝化作用中N20還原酶活性開始受到抑制，代謝產(chǎn)物中，N20/ N2的比例增大。[7-9]

雙氰胺對稻田土壤亞硝化菌產(chǎn)生顯著抑制。

低濃度的雙氰胺（0. 5%）對土壤硝化細菌抑制不顯著，高濃度的雙氰胺（2%）卻能夠明顯抑制硝化細菌的數(shù)量，一般會降低一個數(shù)量級左右。

雙氰胺對土壤反硝化菌僅有輕微抑制，可能是由于雙氰胺對硝化作用NO2-氧化為N03-的抑制，引起作為反硝化作用反應(yīng)底物N03-減少。

展望：

目前，對已經(jīng)開展了對硝化反硝化過程中各種酶的作用機理研究，但是，研究不夠深入，對于各種酶的生化結(jié)構(gòu)、作用機理、不同條件下的酶活性及原因等還有待進一步作深入研究。

2、分子生物學(xué)的方法對土壤中硝化、亞硝化、反硝化等氮循環(huán)細菌進行在不同條件下細菌種群、數(shù)量變化、生化特性、分布、活性等進行研究。從微生物學(xué)的角度探討稻田土壤中氧化亞氮的形成、釋放機理。

參考文獻

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