漳州血柚皮總黃酮超聲波輔助提取工藝研究

陳文娟，陳建福

（1.漳州城市職業(yè)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，福建漳州 363000；2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州 363000）

漳州血柚皮總黃酮超聲波輔助提取工藝研究

陳文娟1，陳建福2

（1.漳州城市職業(yè)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，福建漳州 363000；2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州 363000）

以漳州血柚皮為原料，采用超聲波輔助提取法，以乙醇為提取溶劑提取并測(cè)定總黃酮含量，分別對(duì)乙醇濃度、超聲溫度、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，并通過(guò)極差、方差及多重比較對(duì)提取過(guò)程顯著影響提取率的因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果表明，固定超聲時(shí)間為20 min時(shí)，血柚皮超聲波提取法的最佳工藝條件為：乙醇濃度為55%，超聲溫度為55℃，超聲功率為200 W，料液比為1：20，該工藝條件下血柚皮總黃酮的提取率為1.41%，該工藝提取效率高、提取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單且結(jié)果穩(wěn)定.

血柚皮；總黃酮；超聲波提取

琯溪蜜柚是分布于福建省漳州市平和縣的特有柚子品種，是平和縣的地方傳統(tǒng)名果，也是我國(guó)著名的柚類(lèi)品種之一[1].紅肉蜜柚，一種由漳州平和傳統(tǒng)的琯溪蜜柚基因芽變而誕生的柚類(lèi)新品種，果肉為淡紫紅色，豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì).紅肉蜜柚素有“天然水果罐頭”之稱(chēng)，因其肉色血紅，坊間有人形象地稱(chēng)之為“血柚”，血柚所含的天然色素對(duì)人體具有一定的保健作用.伴隨著血柚年產(chǎn)量的增加，占果實(shí)總量約45%的血柚皮量也逐年增加，血柚皮中含有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的黃酮類(lèi)化合物等多種生理活性成分，具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，可作為抗病毒、抗過(guò)敏、消炎、鎮(zhèn)痛、活血解痙類(lèi)藥物的主要成分[2-6].研究表明，柚皮黃酮類(lèi)化合物提取物會(huì)因柚子產(chǎn)地、柚子品種等不同而有差異[7].本實(shí)驗(yàn)選用漳州血柚皮為原料，以蘆丁為對(duì)照品，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用乙醇溶劑結(jié)合超聲波輔助提取血柚皮中總黃酮并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為血柚皮的深度加工利用提供參考，因此具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

SCQ-3201E超聲波清洗機(jī)，上海聲彥超聲波有限公司；UV－2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司.

血柚皮：漳州市售血柚.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海滬宇生物試劑公司；乙醇，分析純，使用時(shí)，配制成不同濃度的乙醇溶液；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，使用時(shí)，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用80%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，搖勻得到100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液.分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL的容量瓶中，加0.3 mL5%NaNO2溶液，搖勻放置6 min，再加0.3 mL10%Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min，再加4 mL 4%NaOH溶液，搖勻放置20 min，加80%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并繪制黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.2.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及回歸方程

按1.2.1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以蘆丁濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y=0.0102x-0.0013，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999.

1.2.3 提取液中總黃酮的測(cè)定

取一定量的提取液于10 mL容量瓶中，加入一定量的80%的乙醇，加入0.3 mL5%的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加0.3 mL10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，再加4 mL4%的NaOH溶液，搖勻靜置20 min，加80%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，同時(shí)做空白對(duì)照.在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，計(jì)算血柚皮中總黃酮提取率.

1.2.4 血柚皮總黃酮的提取

將市場(chǎng)采購(gòu)的血柚子剝皮，將血柚皮自然晾干，于50℃干燥箱中干燥至恒重，冷卻，粉碎，過(guò)100目篩備用.準(zhǔn)確稱(chēng)取備用的血柚皮粉末5 g，置于250 mL的燒瓶中，于超聲波清洗器中，在設(shè)置的條件下提取血柚皮中的總黃酮，提取結(jié)束后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，定容，按照1.2.3的方法，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，計(jì)算血柚皮中總黃酮的提取率.

其中：C為按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/L)；V為提取液體積/L；m為提取血柚皮的質(zhì)量/g.

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

黃酮類(lèi)物質(zhì)在乙醇中的溶解度比在水中的溶解度大，乙醇濃度對(duì)血柚皮中脂溶性和水溶性物質(zhì)的滲透通過(guò)率有重要的影響.在超聲功率200 W，料液比1：20，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間20 min的條件下，考察乙醇濃度對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖1.

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮的提取率增大，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%時(shí)，總黃酮提取率反而下降.這是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，乙醇對(duì)血柚皮顆粒的作用力增強(qiáng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解性也增強(qiáng)，從植物細(xì)胞溶出率提高，使得黃酮提取率增大，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%時(shí)，血柚皮中其他的雜質(zhì)也被更多地提取出來(lái)，特別是一些醇溶性親脂性強(qiáng)的成分的溶出，增加了與黃酮化合物溶劑的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致總黃酮提取率下降.因此，適宜的乙醇濃度為60%.

2.2 超聲溫度對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲溫度低時(shí)，分子的熱運(yùn)動(dòng)速度低，分子間相互碰撞不激烈，黃酮不能充分溶出，溫度太高，部分黃酮類(lèi)物質(zhì)會(huì)分解或被氧化生成醌類(lèi)物質(zhì)，而使提取效果變差或雜質(zhì)增多.在超聲功率200 W，料液比1：20，乙醇濃度60%，超聲時(shí)間20 min的條件下，考察超聲溫度對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2.

從圖2可以看出，隨著超聲溫度的升高，黃酮提取率增大，當(dāng)超聲溫度達(dá)到50℃時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，黃酮提取率反而下降.這是因?yàn)殡S著溫度的升高，溶劑分子和黃酮類(lèi)物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)加劇，溶劑分子和黃酮類(lèi)物質(zhì)分子的接觸機(jī)會(huì)和次數(shù)增多，擴(kuò)散作用增強(qiáng).從而增大了總黃酮溶出量，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，溫度過(guò)高時(shí)，溶劑汽化嚴(yán)重，阻礙了黃酮的溶出，溫度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)的氧化或水解，使產(chǎn)品性質(zhì)變差.因此，選擇超聲溫度為50℃.

2.3 超聲功率對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

超聲波具有空化效應(yīng)，能產(chǎn)生粉碎、攪拌等功能，使得組織細(xì)胞產(chǎn)生瞬時(shí)的空化泡，從而進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改善組織細(xì)胞的通透性，增加材料中的黃酮的滲透與溶解.在料液比1：20，乙醇濃度60%，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間20 min的條件下，考察超聲功率對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖3.

從圖3可以看出，隨著超聲波功率的增大，血柚皮中總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)超聲波功率達(dá)到200 W時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大，超過(guò)200 W以后，黃酮提取率又開(kāi)始下降.這是因?yàn)殡S著超聲功率的增大，超聲波的空化作用增強(qiáng)，有利于溶劑進(jìn)入血柚皮顆粒內(nèi)部，使得黃酮化合物更易溶出，但當(dāng)超聲波功率大于200 W后，過(guò)高的超聲波功率會(huì)破壞某些黃酮類(lèi)化合物[8]，反而使其提取率降低.因此最佳的超聲波功率為200 W.

2.4 料液比對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

料液比即血柚皮與乙醇溶液的質(zhì)量之比，料液比較小時(shí)，溶劑少，分散不均勻，血柚皮的不溶組分與可溶成分包裹在一起，提取效率差；料液比太大，則溶劑量大，成本高.在超聲功率200 W，乙醇濃度60%，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間20 min的條件下，考察料液比對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖4.

從圖4中可以看出，隨著料液比的增加，血柚皮中總黃酮的提取率增大，當(dāng)料液比達(dá)到1：20以后，增加不再明顯，這是因?yàn)榱弦罕容^小時(shí)，溶劑少，溶劑與柚皮顆粒兩相界面濃度差小，黃酮溶出較少，隨著料液比的增大，柚皮顆粒與溶劑接觸面積及濃度差增大，傳質(zhì)速率提高，當(dāng)料液比達(dá)到1：20后，黃酮已基本溶出，繼續(xù)增加料液比，黃酮提取率增大不再明顯，且溶劑用量過(guò)大，溶劑對(duì)超聲波有一定的吸收損耗，溶劑成本也增大.因此，最佳的料液比為1：20.

圖2 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.5 超聲時(shí)間對(duì)血柚皮總黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率有著重要的影響，在超聲功率200 W，料液比1：20，乙醇濃度60%，超聲溫度50℃的條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)血柚皮中總黃酮提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖5.

從圖5中可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率增大，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間大于20 min時(shí)總黃酮提取率不再增加反而有下降的趨勢(shì).這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，血柚皮中總黃酮已充分溶出，再延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)提取率貢獻(xiàn)不大，且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后，由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)不穩(wěn)定而發(fā)生分解或者轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[9-10].因此適宜的提取時(shí)間為20 min.

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選血柚皮總黃酮提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交表，固定超聲時(shí)間[11]為20 min，以超聲功率，料液比，乙醇濃度，超聲溫度為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素取4水平進(jìn)行優(yōu)選，以總黃酮得率為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表1-表3.

由表2的極差可知，影響血柚皮中提取總黃酮工藝中各影響因素的主次為：B＞A＞C＞D，即超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲功率＞料液比，最佳工藝為B4A2C4D2.將結(jié)果進(jìn)行方差分析得結(jié)果如表3所示，從表3中可以看出，超聲溫度和超聲功率均有極顯著差異（F0≥F0.01），而乙醇濃度和料液比差異顯著（F0.05≤F0＜F0.01）.

圖5 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L16(45)

表2 總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

13 14 15 16 4444 1234 4321 2143 3412 0.95 1.1 0.89 0.99 K1K2K3K4-K1 -K2 -K3 -K4R 4.22 4.6 4.38 3.93 1.055 1.15 1.095 0.9825 0.1675 3.61 4.35 4.48 4.69 0.9025 1.0875 1.12 1.1725 0.27 4.09 3.98 4.43 4.63 1.0225 0.995 1.1075 1.1575 0.1625 4.46 4.50 4.14 4.03 1.115 1.125 1.035 1.0075 0.1175 4.27 4.24 4.26 4..36 1.0675 1.06 1.065 1.09 0.03

2.7 正交試驗(yàn)各處理間的多重比較

2.7.1 乙醇濃度各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

從表4的SSR檢驗(yàn)可以看出，乙醇濃度水平2與水平3不存在顯著性差異（P＞0.05），而與水平1存在顯著性差異（P＜0.05），與水平4之間存在極顯著差異（P＜0.01）.水平3和水平1之間不存在顯著性差異（P＞0.05），但與水平4存在極顯著性差異（P＜0.01）.所以最佳的乙醇濃度為55%和60%，其次為50%，而60%不合適.因乙醇濃度55%和60%不存在差異，從生產(chǎn)成本考慮，選擇55%為最佳，故將乙醇濃度修正為55%.

2.7.2 超聲溫度各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

從表5的SSR檢驗(yàn)可以看出，超聲溫度水平4與水平3和水平2存在顯著性差異（P＜0.05），與水平1之間存在極顯著性差異（P＜0.01）.水平3與水平2不存在顯著性差異（P＞0.05），但與水平1存在極顯著性差異（P＜0.01），水平2和水平1存在極顯著性差異（P＜0.01）.所以最佳的超聲溫度為55℃，其次是50℃和45℃，而40℃不合適.

2.7.3 超聲功率各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

從表6的SSR檢驗(yàn)可以看出，超聲功率水平4與水平3不存在顯著性差異（P＞0.05），水平4與水平1和水平2存在極顯著性差異（P＜0.01）.水平3和水平1存在顯著性差異（P＜0.05），水平3與水平2存在極顯著性差異（P＜0.01）.水平1和水平2之間不存在顯著性差異（P＞0.05）.所以最佳的超聲功率為210 W和200 W，其次是180 W和190 W，因210 W和200 W不存在差異，從節(jié)能角度考慮，選擇200 W為最佳.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表4 乙醇濃度各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

表5 超聲溫度各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

表6 超聲功率各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

2.7.4 料液比各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

從表7的SSR檢驗(yàn)可以看出，料液比水平2和水平1不存在顯著性差異（P＞0.05），水平2和水平3存在顯著性差異（P＜0.05），而與水平4存在極顯著性差異（P＜0.01），水平1與水平3、水平4存在顯著性差異（P＜0.05），水平3和水平4不存在顯著性差異（P＞0.05）.所以最佳的料液比為1：20和1：22，其次是1：18和1：15.由于料液比1：20和1：22不存在差異，從成本上考慮，可將料液比的最佳工藝參數(shù)修正為1：20.

2.8 驗(yàn)證結(jié)果

取一定量樣品，根據(jù)篩選得到的超聲波輔助提取血柚皮中的總黃酮的最佳工藝條件和修正后的最佳工藝做3組平行試驗(yàn)，測(cè)定總黃酮的提取率如表8所示，從表8中可以看出，根據(jù)超聲波輔助提取的最佳提取工藝所測(cè)得的總黃酮提取率均大于正交設(shè)計(jì)表中其他提取條件下總黃酮的提取率，且提取條件修正對(duì)提取結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響.

表7 料液比各水平間差異顯著性的SSR檢驗(yàn)

表8 總黃酮提取率（%）

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的有效結(jié)合對(duì)超聲波輔助提取血柚皮中總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)超聲過(guò)程各影響因素進(jìn)行多重比較，獲得最佳提取工藝條件：乙醇濃度55%，超聲溫度55℃，超聲功率200 W，料液比1：20，超聲時(shí)間20 min，在此條件下血柚皮總黃酮提取率為1.41%.對(duì)極差分析的最佳工藝和多重比較修正后的最佳工藝進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，表明最佳工藝參數(shù)穩(wěn)定、可靠，具有提取效率高、節(jié)能、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的提取血柚皮總黃酮的方法.

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Ultrasonic-Assisted Technology for Total
Flavonoids Extraction from Blood Pummelo Peel

CHEN Wen-juan1,CHEN Jian-fu2
(1.Department of Biological and Environmental Engineering,Zhangzhou City College,Zhangzhou 363000,China; 2.Department of Food and Biology Engineering,Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000,China)

The total flavonoids from blood pummelo peel were carried out by ultrasonic extraction using ethanol as solvent.The effects of parameters including ethanol concentration,ultrasonic-wave temperature,ultrasonic-wave power,material-to-liquid ratio,ultrasonic-wave time on extraction yield were investigated by single factor test and orthogonal array design methods.And the notability difference was analyzed with the statistic method of range,vari?ance and multiple comparisons.Results showed that the optimal conditions were as follows when the ultrason?ic-wave time was 20 min constantly:the concentration of ethanol was 55%,the ultrasonic-wave temperature of ex?traction was 55℃,and the ratio of material to liquid was 1:20.The extraction yield of the total flavonoids from blood pummelo peel was reached up to 1.41%.The optimized ultrasonic extraction process was efficient,rapid,sim?ple,and the result was stable.

blood pummelo peel;total flavanoids;ultrasonic extraction

R284.2

A

1008-2794（2012）04-0057-07

2012-02-17

陳文娟（1984—），女，福建漳州人，助教，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程.

陳建福（1982—），男，福建南安人，講師，博士，研究方向：化學(xué)工程與技術(shù)，E-mail：qjf1996@163.com.