高壓氧對(duì)小鼠脛骨骨折愈合過(guò)程中骨生物力學(xué)特性及膠原蛋白含量的影響

譚 嘉，譚海濤，陳國(guó)平，李 曉，鄧貴全，黃曉榮，甘 智，梁旭權(quán)

基礎(chǔ)研究

高壓氧對(duì)小鼠脛骨骨折愈合過(guò)程中骨生物力學(xué)特性及膠原蛋白含量的影響

譚 嘉，譚海濤，陳國(guó)平，李 曉，鄧貴全，黃曉榮，甘 智，梁旭權(quán)

目的探討高壓氧對(duì)小鼠脛骨骨折愈合過(guò)程中骨生物力學(xué)特性及膠原蛋白含量的影響。方法采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法將216只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（108只）和高壓氧組（108只），建立脛骨骨折模型。高壓氧組予以高壓氧治療，對(duì)照組不予高壓氧治療。分別于骨折后1、2、3、4周取材，取材前通過(guò)行為學(xué)評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)兩組小鼠的行為學(xué)特征，觀察取材后脛骨的一般生物學(xué)特征，檢測(cè)脛骨標(biāo)本的抗扭力和抗折力，測(cè)定脛骨骨痂組織的膠原蛋白含量，同時(shí)采用改良Masson染色對(duì)骨痂組織中的膠原蛋白進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果與對(duì)照組相比，高壓氧組小鼠骨折后1、2周行為學(xué)評(píng)分降低；2、3、4周斜板實(shí)驗(yàn)坡度升高（P＜0.05）。骨折后1周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨寬度（骨痂處）、脛骨抗折力均大于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；骨折后2周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨抗扭力高于對(duì)照組，骨折后1、2、3周右側(cè)與左側(cè)脛骨抗扭力比值以及兩側(cè)脛骨抗折力比值均高于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高壓氧組小鼠骨折后1、2、3、4周骨痂膠原纖維含量高于對(duì)照組（P＜0.05），且高壓氧組改良Masson染色出現(xiàn)較多的藍(lán)色反應(yīng)。結(jié)論在小鼠脛骨骨折的愈合過(guò)程中，高壓氧治療提高了骨痂組織中膠原蛋白的含量，增強(qiáng)了骨的生物力學(xué)性能，對(duì)骨折愈合起到促進(jìn)作用。

高壓氧；脛骨骨折；骨折愈合；生物力學(xué)；膠原蛋白；小鼠

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展以及交通事故的增多，創(chuàng)傷性骨折的發(fā)生率呈逐年升高的趨勢(shì)。體外研究結(jié)果顯示，高壓氧狀態(tài)有助于軟骨樣組織向骨組織的轉(zhuǎn)化，同時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化有促進(jìn)作用[1-2]；而骨膠原蛋白的合成、分泌與骨修復(fù)的質(zhì)量直接相關(guān)[3-5]。臨床研究亦證實(shí)，高壓氧具有促進(jìn)骨折愈合的作用[6-9]。本研究通過(guò)制作小鼠脛骨骨折的動(dòng)物模型，觀察高壓氧治療后骨折愈合處骨生物力學(xué)特性及膠原蛋白含量的改變，探討高壓氧在骨折愈合中的作用機(jī)制，為臨床上高壓氧療法在創(chuàng)傷骨科的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6周齡SPF級(jí)昆明小鼠（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2009-0002）216只，雌雄不拘，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法隨機(jī)分為高壓氧組（108只）和對(duì)照組（108只）。

1.2 主要試劑、儀器和設(shè)備

羥脯氨酸測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），改良Masson三色染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品）。

動(dòng)物高壓氧艙（青島平度高壓氧艙設(shè)備廠），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、分析天平（上海精科儀器公司），恒溫水箱（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），恒溫干燥箱（南通泰宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品），Olympus顯微鏡（Olympus公司，日本），扭力計(jì)（臺(tái)灣路昌儀器公司），折力實(shí)驗(yàn)裝置（自制），量角器、游標(biāo)卡尺（市售）。

1.3 脛骨骨折模型的制作

高壓氧組和對(duì)照組均在小鼠右側(cè)脛骨（模型側(cè)）制作骨折模型，左側(cè)脛骨（對(duì)照側(cè)）不作處理。以10%（100 mg/kg）水合氯醛腹腔麻醉成功后，左手捉拿小鼠的背部，右手觸摸到小鼠右側(cè)脛骨后，在中段以食指固定，向外側(cè)折斷脛骨，聽(tīng)到“嗒”的一聲視為骨折成功，然后立刻予以復(fù)位，復(fù)位后未采用任何形式的內(nèi)固定或外固定。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理

行骨折處理后，高壓氧組于每天下午16時(shí)至17時(shí)予以高壓氧治療（用99.2%氧氣沖洗艙3次后，在20 min內(nèi)使艙內(nèi)壓力升至0.2 MPa，氧氣濃度維持在95%～97%，并保持該壓力60 min，減壓20 min后出艙），1次/d；對(duì)照組不予高壓氧治療。兩組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。分別于骨折后1、2、3、4周取材。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)特征 各時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)選取16只小鼠稱量體質(zhì)量，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上自由走動(dòng)。按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行痛行為學(xué)評(píng)分[10]：0分：行動(dòng)正常，模型側(cè)和對(duì)照側(cè)后肢動(dòng)作相同；1分：模型側(cè)后肢有跛行，但行走不需抬高患肢；2分：模型側(cè)后肢跛行明顯，有停步抬高患肢現(xiàn)象；3分：不能使用模型側(cè)患肢。斜板實(shí)驗(yàn)[11]：將小鼠放在1塊100 cm×50 cm的光滑玻璃板上（距玻璃板底60 cm），以玻璃板平面和水平線為夾角，緩慢勻速抬起玻璃板的另一端，量角器記錄小鼠在玻璃板上滑下時(shí)的夾角度數(shù)，重復(fù)3次。測(cè)試完畢后放回籠中備用。

1.5.2 脛骨一般生物學(xué)特征 各時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)選取16只小鼠行頸椎脫臼處死后，迅速剝離左、右兩側(cè)脛骨，剔除筋膜及軟組織并稱取濕重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量脛骨的長(zhǎng)度和寬度，然后將骨標(biāo)本置入EP管內(nèi)標(biāo)記備用。

1.5.3 脛骨抗扭力 每組隨機(jī)選取8份測(cè)量后的骨標(biāo)本，用扭力計(jì)測(cè)定左、右側(cè)脛骨抗扭力，并計(jì)算右側(cè)與左側(cè)脛骨抗扭力的比值。實(shí)驗(yàn)后全部骨組織回收至EP管內(nèi)，放入60℃烤箱24 h后記錄脛骨干重。

1.5.4 脛骨抗折力 用抗折力裝置分別測(cè)定兩組剩余8份測(cè)量后骨標(biāo)本左、右側(cè)脛骨的抗折力。參照文獻(xiàn)[10]自行制作抗折力裝置：用鐵架臺(tái)固定一特制鋼條，鋼條前端有一約長(zhǎng)2 cm、寬1 cm的孔。將骨標(biāo)本橫向固定在鋼條的孔隙中間，用粗線將水瓶懸掛在骨折處，測(cè)試時(shí)緩慢加水至標(biāo)本折斷，每次用天平稱量水瓶及水的總重量，該重量即為脛骨的抗折力。同時(shí)計(jì)算右側(cè)與左側(cè)脛骨抗折力的比值。實(shí)驗(yàn)后全部骨組織回收至EP管內(nèi)，置入60℃烤箱24 h后記錄脛骨干重。

1.5.5 脛骨骨痂處膠原蛋白

1.5.5.1 含量 各時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)選取8只小鼠，頸椎脫臼處死后迅速取其右側(cè)脛骨骨痂組織50～80 mg，置于6 mmol/L的氫氯酸中，95℃水浴消化5 h，取出消化液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣品中羥脯氨酸的含量，并計(jì)算骨痂組織中膠原蛋白的含量（羥脯氨酸含量/13.4%）。

1.5.5.2 組織學(xué)觀察 各時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)選取3只小鼠，行頸椎脫臼處死解剖后在小鼠骨折處取骨痂上下0.5 cm左右組織，經(jīng)多聚甲醛固定、脫蠟后包埋、石蠟切片后，采用改良Masson三色染色法[12]觀察骨痂處膠原蛋白的改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ-±s）表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化情況

骨折后1、2、3、4周高壓氧組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1），提示高壓氧對(duì)小鼠的體質(zhì)量無(wú)明顯影響。

2.2 痛行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

骨折后兩組小鼠右側(cè)肢體均出現(xiàn)嚴(yán)重跛行，視為3分。隨著骨折的愈合，痛行為學(xué)評(píng)分逐漸降低。如表2所示，高壓氧組小鼠骨折后1、2周痛行為學(xué)評(píng)分低于對(duì)照組（P＜0.05），3、4周兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 對(duì)照組與高壓氧組小鼠骨折后各時(shí)相點(diǎn)體質(zhì)量的比較結(jié)果（χ-±s，n=16，g）

表2 對(duì)照組與高壓氧組小鼠骨折后各時(shí)相點(diǎn)痛行為學(xué)評(píng)分的比較結(jié)果（χ-±s，n=16，分）

表3 對(duì)照組與高壓氧組小鼠骨折后各時(shí)相點(diǎn)斜板實(shí)驗(yàn)坡度的比較結(jié)果（χ-±s，n=16，°）

2.3 斜板實(shí)驗(yàn)坡度

如表3所示，隨著時(shí)間的推移，兩組斜板實(shí)驗(yàn)坡度逐漸增高。與對(duì)照組比較，高壓氧組小鼠骨折后2、3、4周斜板實(shí)驗(yàn)坡度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 脛骨長(zhǎng)度和寬度

如表4所示，骨折后1周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨寬度（骨痂處）大于對(duì)照組（P＜0.05），其余指標(biāo)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；骨折后2、3、4周高壓氧組雙側(cè)脛骨寬度、長(zhǎng)度與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 脛骨濕重和干重

如表5所示，各時(shí)相點(diǎn)高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨濕重、干重以及干重/濕重比值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 脛骨抗扭力

如表6所示，各時(shí)相點(diǎn)兩組小鼠左側(cè)脛骨的抗扭力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；骨折后1、3、4周兩組右側(cè)脛骨抗扭力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但骨折后2周時(shí)高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨抗扭力高于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，高壓氧組小鼠骨折后1、2、3周右側(cè)與左側(cè)脛骨抗扭力比值高于對(duì)照組（P＜0.05），但骨折后4周兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.7 脛骨抗折力

如表7所示，各時(shí)相點(diǎn)兩組小鼠左側(cè)脛骨抗折力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；骨折后1周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨抗折力高于對(duì)照組（P＜0.05），骨折后2、3、4周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨抗折力與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05 ）。此外，骨折后1、2、3周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨與左側(cè)脛骨抗折力比值高于對(duì)照組（P＜

0.05 ），骨折后4周兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.8 脛骨骨痂膠原蛋白含量

如表8所示，高壓氧組各時(shí)相點(diǎn)脛骨骨痂膠原蛋白含量均高于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。改良Masson染色組織學(xué)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，兩組改良Masson染色中藍(lán)色反應(yīng)逐漸增多，而高壓氧組小鼠骨折后3、4周的組織藍(lán)染明顯強(qiáng)于對(duì)照組（圖1，2）。

3 討論

高壓氧治療目前已成為臨床治療學(xué)的一個(gè)重要組成部分，應(yīng)用日趨廣泛。近幾年來(lái)，諸多文獻(xiàn)報(bào)道了高壓氧對(duì)骨折愈合的影響，研究結(jié)果證實(shí)，高壓氧能夠增加動(dòng)脈血氧的部分壓力，擴(kuò)大彌散量和彌散距離，提高血到組織的氧溶解能力，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成，有助于骨折后成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管的形成，進(jìn)而加速骨折愈合和骨生成[13-15]。

表4 對(duì)照組與高壓氧組骨折后各時(shí)相點(diǎn)小鼠脛骨長(zhǎng)度和寬度的比較結(jié)果（χ-±s，n=16，mm）

有研究結(jié)果顯示，對(duì)植入人重組骨形成蛋白的大鼠給予高壓氧治療，其新骨形成明顯高于不予高壓氧治療的對(duì)照組[16]。本研究結(jié)果亦顯示，骨折后1周高壓氧組小鼠右側(cè)脛骨寬度（骨痂處寬度）顯著增加，說(shuō)明高壓氧可能通過(guò)加速骨折愈合初期骨痂的形成，以達(dá)到對(duì)骨折愈合的正向促進(jìn)作用；研究結(jié)果還顯示，高壓氧組小鼠骨折后1、2周痛行為學(xué)評(píng)分低于對(duì)照組，骨折后2、3、4周斜板實(shí)驗(yàn)坡度升高，表明高壓氧治療在減輕骨折疼痛的同時(shí)，可能還具有改善脛骨骨折肢體功能恢復(fù)的功效，這些結(jié)果都是證實(shí)高壓氧促進(jìn)小鼠脛骨骨折愈合的有力證據(jù)。

骨膠原蛋白是人體骨骼、關(guān)節(jié)軟骨、骺軟骨和骨小梁的主要組分，主要分布于骨松質(zhì)。有研究結(jié)果顯示，骨膠原蛋白含量的增加可導(dǎo)致骨小梁變厚，韌性增加[17]。而羥脯氨酸是骨膠原蛋白中特有的氨基酸，因此測(cè)量骨痂組織羥脯氨酸的含量，可以間接反映骨組織中膠原蛋白含量的變化。本研究結(jié)果顯示，高壓氧組小鼠骨折后1、2、3周右側(cè)與左側(cè)脛骨抗扭力的比值及抗折力的比值

均高于對(duì)照組，同時(shí)，高壓氧組小鼠骨痂組織的膠原蛋白含量在各時(shí)相點(diǎn)均高于對(duì)照組，提示高壓氧治療能夠提升骨組織的抗折彎能力和韌性，促進(jìn)骨生物力學(xué)性能的恢復(fù)；而其抗折彎能力和韌性的增強(qiáng)可能與骨骼中膠原蛋白含量的增加有相關(guān)關(guān)系。

表5 對(duì)照組與高壓氧組骨折后各時(shí)相點(diǎn)小鼠右側(cè)脛骨濕重和干重的比較結(jié)果（χ-±s，n=16）

表6 對(duì)照組與高壓氧組骨折后各時(shí)相點(diǎn)小鼠脛骨抗扭力的比較結(jié)果（χ-±s，n=8）

表7 對(duì)照組與高壓氧組骨折后各時(shí)相點(diǎn)小鼠抗折力的比較結(jié)果（χ-±s，n=8）

表8 對(duì)照組與高壓氧組骨折后各時(shí)相點(diǎn)小鼠脛骨骨痂膠原蛋白含量的比較結(jié)果（χ-±s，n=8，μg/mg）

改良Masson染色可用來(lái)評(píng)價(jià)骨質(zhì)的成熟程度，特別是在骨折愈合過(guò)程中，可作為評(píng)價(jià)骨痂成熟程度的重要指標(biāo)，即藍(lán)色著染的比例越多，膠原蛋白含量越高，骨痂越成熟[18]。我們觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，兩組改良Masson染色中藍(lán)色反應(yīng)均逐漸增多，說(shuō)明骨折愈合過(guò)程中膠原蛋白含量呈升高趨勢(shì)，骨痂也在逐漸生長(zhǎng)；但與對(duì)照組比較，高壓氧組小鼠骨折后3、4周的組織染色明顯增多，證實(shí)高壓氧治療進(jìn)一步提高了骨痂組織中膠原蛋白的含量，加速了骨痂組織的成熟。

需要強(qiáng)調(diào)的是，成熟骨中約90%的有機(jī)質(zhì)是膠原，占骨干重的30%左右；而90%以上的無(wú)機(jī)質(zhì)是礦物質(zhì)鈣、磷沉積形成的羥基磷灰石[17]。載體骨膠原的增多導(dǎo)致骨鹽沉積增加，使骨重增加，因此脛骨干重與骨膠原、鈣、磷含量的綜合測(cè)定可以反映骨量的變化以及骨的礦化程度。盡管本研究中兩組小鼠在骨濕重、干重及干濕重比值方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高壓氧治療對(duì)骨鈣、磷等其他礦物含量及代謝情況的影響仍值得進(jìn)一步關(guān)注。

綜上所述，高壓氧治療可以促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中早期骨痂的形成，加速骨生物力學(xué)性能的恢復(fù)，其機(jī)制可能是通過(guò)增加骨痂組織中膠原蛋白含量來(lái)促進(jìn)骨痂組織成熟，進(jìn)而有助于骨折愈合。

圖1 對(duì)照組骨痂膠原蛋白改良Masson染色組織學(xué)結(jié)果（×40）1A骨折后1周 1B骨折后2周 1C骨折后3周 1D骨折后4周 圖2高壓氧組骨痂膠原蛋白改良Masson染色組織學(xué)結(jié)果（×40）2A骨折后1周 2B骨折后2周 2C骨折后3周 2D骨折后4周

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Effect of hyperbaric oxygen on the biomechanic characteristics and the content of collagen of the bone during tibial fracture healing in mice

TAN Jia,TAN Haitao,CHEN Guoping,LI Xiao,DENG Guiquan,HUANG Xiaorong,GAN Zhi,LIANG Xuquan.Orthopaedic Department,Guigang People's Hospital,Guangxi 537100,China.

TAN Haitao,E-mail：tanhaitao99@hotmail.com

Objective To explore the effect of hyperbaric oxygen（HBO）on the biomechanic characteristics and the content of collagen of the bone during tibial fracture healing in mice.Methods Models of tibial fracture were made in 216 mice which were randomly divided into control group(n=108)and HBO group(n=108)by simple random sampling.HBO group was treated by HBO while control group was not given HBO.Animal behavioral features were observed in two groups according to the behavioral scores and the oblique plate assay. Then samples were prepared at 1,2,3 and 4 weeks after the fracture,general biological features of tibia were recorded,torsional forces and anti-fracture forces of the bone samples were examined,the content and the histological results of collagen in tibial bony callus tissue were evaluated.Results Compared with the control group,the behavioral scores in HBO group were lower at 1 and 2 weeks after the fracture,while the angle value through oblique plate assay showed continuously higher at 2,3 and 4 weeks after the fracture(P＜0.05).For HBO group,the width of osteotylus and anti-fracture forces of the right tibia were greater than those of control group at 1 week after the fracture,the difference between two groups had statistical significance(P＜0.05); torsional forces of the right tibia was stronger than that of control group at 2 week after the fracture,the ratio of torsional forces,and the ratio of anti-fracture forces between right and left tibia were higher than those of control group at 1,2 and 3 weeks after the fracture(P＜0.05),the difference had statistical significance(P＜0.05).The content of collagenous fiber in osteotylus showed higher in HBO group than that in control group at 1,2,3 and 4 weeks after the fracture(P＜0.05),furthermore,more and more blue color reaction responded to the modified Masson staining could be seen continuously in HBO group.Conclusion HBO can increase the content of collagen in bony callus tissue and enhance the biomechanic features of bone which will improve the bone healing.

Hyperbaric oxygenation;Tibial fractures;Frature healing;Biomechanics;Collagen;Mice

R459.6，R683.423

A

1674-666X(2012)01-0048-09

2011-12-20；

2012-01-24）

（本文編輯 白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2012.01.008

537100廣西省貴港市人民醫(yī)院骨科

譚海濤，E-mail：tanhaitao99@hotmail.com