耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在肺炎致病機(jī)制中的研究進(jìn)展

王 芊，華 川

自1961年Jevone首次報(bào)道耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)以來(lái)，其感染幾乎遍布全球，已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一［1］。MRSA可引起多種感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、局部組織化膿性感染等。正是由于MRSA引起醫(yī)院內(nèi)感染的多重耐藥性，其感染已被列為最難解決的三大感染性疾病之一［2］。MRSA引起的肺部感染的比例呈上升趨勢(shì)?，F(xiàn)就MRSA在肺炎致病機(jī)制中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 概述

MRSA在體外藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)甲氧西林耐藥，但因?yàn)榧籽跷髁只瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，通常以苯唑西林代替進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(national committee for clinical laboratory standards，NCCLS)的建議，凡檢出mecA基因或青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin-binding trotein 2a，PBP2a)的葡萄球菌即可診斷為MRSA［3］。故直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌中的耐藥基因mecA的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法被公認(rèn)為檢測(cè)MRSA 的“金標(biāo)準(zhǔn)”［4］。

2 MRSA耐藥機(jī)制

MRSA除對(duì)甲氧西林耐藥外，對(duì)其他所有與甲氧西林有相同結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類和β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合抗菌藥物均耐藥，還可通過(guò)產(chǎn)生修飾酶、改變抗菌藥物作用靶位、降低膜通透性等機(jī)制，對(duì)氨基苷類、大環(huán)內(nèi)酯類－林可酰胺－鏈陽(yáng)菌素B及其衍生物奎奴普汀類、喹諾酮類等抗菌藥物產(chǎn)生不同程度耐藥。MRSA多藥耐藥特性與菌株攜帶的耐藥基因密切相關(guān)。

2.1 葡萄球菌盒式染色體(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)MRSA 對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥原因在于MRSA攜帶mecA基因。mecA基因編碼一種新型PBP2a。在對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌中，只存在內(nèi)源性PBP，它是細(xì)菌細(xì)胞壁合成時(shí)所必需的轉(zhuǎn)肽酶，這種酶容易與β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合而失去活性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁合成障礙，進(jìn)而殺死細(xì)菌［5］。然而在MRSA中，PBP被PBP2a取代，PBP2a對(duì)青霉素類抗生素的親和力低，結(jié)合力弱，因此青霉素類抗生素?zé)o法結(jié)合并作用于PBP2a，使其活性不被抑制。因此，MRSA可以通過(guò)PBP2a持續(xù)合成細(xì)胞壁，從而得以生長(zhǎng)，表現(xiàn)為對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素、半合成青霉素、第2代頭孢菌素)耐藥［6］。而mecA基因就存在于攜帶mec基因的SCCmec這樣一個(gè)可移動(dòng)基因元件中。

SCCmec由 mec、ccr復(fù)合體和 J 區(qū)域構(gòu)成［7］。mecA為結(jié)構(gòu)編碼基因，可編碼產(chǎn)生PBP2a;ccr復(fù)合體將 SCCmec從特定位點(diǎn)——SCCmec attachment site(attBscc)刪除或整合進(jìn)金黃色葡萄球菌染色體中。而末端正序重復(fù)序列(direct repeat sequence，DR)、反序重復(fù)序列(inverted repeat sequence，IR)和J區(qū)域，有助于SCCmec在細(xì)菌細(xì)胞間的傳遞［8］。每個(gè)SCCmec元件具有3個(gè)J區(qū)。1個(gè)SCCmec元件組成結(jié)構(gòu)包括J3-mec-J2-ccr-J1。J區(qū)包含多種對(duì)細(xì)菌細(xì)胞不重要、無(wú)用的基因和假基因及一些從質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子獲得的對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗生素和重金屬耐藥的基因?，F(xiàn)在認(rèn)為它們是細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境、從外界獲得的對(duì)生存有益的基因。此外，J區(qū)域是區(qū)分SCCmec亞型的依據(jù)之一［9］。

Berger和 Rohrer［10］及周義正等［11］研究均表明，mecA基因表達(dá)水平與葡萄球菌屬對(duì)甲氧西林的耐藥水平并無(wú)明顯相關(guān)性，即影響葡萄球菌屬對(duì)甲氧西林耐藥水平的相關(guān)基因是位于SCCmec外的一群以fem基因?yàn)榇淼墓芗一?，femA是MRSA表達(dá)對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素高水平耐藥所必需的，這些基因能直接或間接在肽聚糖的生物合成中發(fā)揮作用，并具有其他調(diào)控功能，但對(duì)PBP2a表達(dá)并無(wú)影響。

2.2 主動(dòng)外排系統(tǒng) 有研究顯示，MRSA中存在多種主動(dòng)外排系統(tǒng)，可顯著降低細(xì)胞內(nèi)抗菌藥物的濃度，同時(shí)由于主動(dòng)外排系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)底物的廣泛性，使細(xì)菌呈現(xiàn)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的抗菌藥物高度耐藥。主動(dòng)外排是金黃色葡萄球菌耐喹諾酮類抗菌藥物的重要機(jī)制之一［12］。金黃色葡萄球菌還存在qae、smr等多種外排系統(tǒng)，qae外排泵研究較多。qac基因是位于金黃色葡萄球菌不同質(zhì)粒上消毒劑抗性決定因子，根據(jù)其抗性情況及DNA同源性可分為兩大家族，即:qacA/qacB及qacC/qacD家族，都編碼對(duì)染料及季銨鹽類的抗性。qacA/B基因表達(dá)外排泵蛋白，獲得qacA/B基因可表現(xiàn)對(duì)胺類(如苯扎溴銨)、胍類(如雙氯苯艤胍已烷)和腙類消毒劑耐藥［13］。qac家族除對(duì)消毒劑耐藥外，對(duì)多種抗菌藥物存在高耐藥率。近年來(lái)，有學(xué)者證明MRSA攜帶的qac外排泵還能外排左氧氟沙星和利福平［14］，提示qae外排泵對(duì)MRSA多重耐藥性的產(chǎn)生也有一定作用。

2.3 van基因 隨著MRSA對(duì)萬(wàn)古霉素等糖肽類抗菌藥物的敏感性不斷降低［15］，耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，MRSA對(duì)糖肽類抗生素(以萬(wàn)古霉素、替考拉寧為代表)耐藥機(jī)制研究也日益受到重視。有研究顯示，通過(guò)質(zhì)粒從腸球菌轉(zhuǎn)移來(lái)的van基因，能改變糖肽類藥物靶位，是耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌對(duì)糖肽類抗生素耐藥性的主要機(jī)制［16］。

3 MRSA致病機(jī)制

金黃色葡萄球菌可以分泌20多種毒性蛋白質(zhì)，如溶血毒素、殺白細(xì)胞毒素(panton-valentine leukocid，PVL)、腸毒素、中毒性休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin，TSST-1)等都是重要的致病物質(zhì)，可引起不同嚴(yán)重程度的臨床表現(xiàn)。近年來(lái)，PVL及TSST在金黃色葡萄球菌感染的肺炎研究中日益受到重視。

PVL是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素，通過(guò)噬菌體攜帶后與金黃色葡萄球菌的染色體結(jié)合，是重要的致病因子，其通過(guò)2種分泌型蛋白(Luks-PV和Lukf-PV)的協(xié)同作用(這2種成分各自均無(wú)細(xì)胞毒性，結(jié)合后才產(chǎn)生細(xì)胞毒性)，攻擊中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，作用于白細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，鉀離子丟失，最終使細(xì)胞死亡［17］，可在兒童和成人患者中引起壞死性肺炎等。攜帶PVL基因的MRSA在美國(guó)、歐洲、亞洲和非洲等國(guó)家有引起嚴(yán)重感染的報(bào)道，甚至在有些國(guó)家造成克隆株的播散，主要引起化膿性感染和嚴(yán)重的肺部感染［18-19］。據(jù)研究顯示金黃色葡萄球菌肺炎病死率為10%，而攜帶PVL基因病死率高達(dá)75%［20］。此外，雖然多項(xiàng)研究已表明PVL與社區(qū)獲得性肺炎感染密切相關(guān)［21-23］，但有關(guān)PVL許多問(wèn)題仍未解決，包括其在侵入性疾病期間大量表達(dá)以及人體免疫對(duì)其的作用［24］。

TSST-1是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種外毒素，可引起機(jī)體發(fā)熱及休克，并增加對(duì)內(nèi)毒素的敏感性，屬于致熱源性超抗原家族，其在介導(dǎo)感染性休克和臟器損害中具有重要意義。李宏等［25］研究顯示，同時(shí)攜帶PVL和TSST-1基因的MRSA可導(dǎo)致更嚴(yán)重的感染性疾病，呈現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥性，增加了臨床抗感染治療的難度，甚至危及患者生命。

4 MRSA分型研究在肺炎致病機(jī)制中的應(yīng)用

4.1 SCCmec分型 根據(jù)mec和ccr復(fù)合體的不同組合以及SCCmec原件上的不同特異性位點(diǎn)對(duì)SCCmec進(jìn)行分型。研究表明，SCCmec分型是區(qū)分醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的一個(gè)重要指標(biāo)，醫(yī)院獲得性肺炎感染的MRSA菌株，常攜帶的是Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型SCCmec中的一種，而社區(qū)獲得性肺炎感染MRSA或非MRSA菌株攜帶的是Ⅳ或Ⅷ型SCCmec。此外，還可以探討菌株間的遺傳進(jìn)化聯(lián)系和耐藥基因攜帶狀況，是分子流行病學(xué)和耐藥機(jī)制研究的一種重要手段。對(duì)地區(qū)性MRSA進(jìn)行SCCmec分型，不但可以探明其流行株的SCCmec型別、分布、耐藥基因攜帶現(xiàn)狀，為預(yù)測(cè)其耐藥性發(fā)展趨勢(shì)、有效治療其感染、預(yù)防其暴發(fā)流行提供對(duì)策和依據(jù)，而且可為新藥開(kāi)發(fā)尋找突破口、為耐藥機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，并能與其他國(guó)家或地區(qū)的MRSA進(jìn)行對(duì)比研究［26］。

4.2 多位點(diǎn)測(cè)序(MLST分型)及隨機(jī)引物PCR(AP-PCR)分型 金黃色葡萄球菌7個(gè)管家基因，即氨基甲酸激酶基因(carbamatek inase，arcC)、莽草酸脫氫酶基因(shik imatedehydrogenase，aroE)、甘油激酶基因(glycerol kinase，glp)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸激酶基因(guanylate kinase，gmk)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(phosphate acetyltransferase，pta)、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(triosephosphate isomerase，tpi)和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(acetyle coenzyme A acetyltransferase，yqi)。選擇7個(gè)管家基因450～500 bp的片段進(jìn)行分析，每個(gè)基因片段不同的序列被認(rèn)定為不同的等位基因點(diǎn)，每個(gè)管家基因就有多個(gè)等位基因點(diǎn)，每株細(xì)菌都可通過(guò)7個(gè)管家基因的不同等位基因點(diǎn)進(jìn)行序列分型［27］。由于7個(gè)管家基因都有不同的等位基因點(diǎn)且基因序列發(fā)生變異的速度非常緩慢，只有來(lái)自同一克隆株的菌株間才有可能具有同一基因序列型。張雪青等［28］通過(guò)這一分型來(lái)研究MRSA在肺部感染流行株的起源、不同菌株間的關(guān)系，以探明本地流行株與世界流行株之間的關(guān)系，取得了一定的進(jìn)展。

AP-PCR是在相當(dāng)?shù)偷耐嘶饻囟认?，采用單一引物非特異性地識(shí)別細(xì)菌染色體上的相應(yīng)位點(diǎn)，使之發(fā)生多位點(diǎn)結(jié)合，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳，產(chǎn)生復(fù)雜基因組的指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜的多樣性可進(jìn)行分型。AP-PCR分型已成為MRSA分型研究的一個(gè)重要方向。

5 結(jié)語(yǔ)

MRSA所致肺部感染大多發(fā)生在免疫力低下、伴嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病以及新生兒，術(shù)后及大面積燒傷、長(zhǎng)期在重癥監(jiān)護(hù)室、高齡、意識(shí)障礙、侵入性操作是MRSA感染的危險(xiǎn)因素。此外，MRSA有向社區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)，在社區(qū)獲得性感染中MRSA所占比例逐年上升，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，有效預(yù)防和控制多重耐藥菌感染已成為重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。依據(jù)藥敏監(jiān)測(cè)結(jié)果，優(yōu)化選擇抗菌藥物，合理選擇抗生素等對(duì)MRSA防治尤為重要;對(duì)MRSA分布調(diào)查及耐藥性研究都是今后重要的研究方向。

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